Abstract

Durante el periodo 2024-1 del semillero de ingeniería genética-GENEIA estuvo dedicado a la producción a escala analítica de un lote piloto de la enzima Tth DNA polimerasa. Iniciamos con el cultivo e inducción del clon productor de la enzima Tth perteneciente al proyecto de investigación INVCO0542023 (Figura 1), La biomasa bacteriana fue cosechada en un solo botón, luego fue sometida a lisis celular empleando un sonicador de punta y tratamiento con lisozima. De este tratamiento se obtuvieron dos fracciones, una denominada como soluble y la otra como insoluble, de las cuales una fue elegida para proceder a la fase de purificación de la proteína (según donde se halle la mayor cantidad de proteína recombinante por SDS-PAGE). En el diseño de la proteína recombinante, también se adiciona un dominio correspondiente a una cola His-Tag, lo que permite que la purificación de la proteína se pueda realizar mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA (Dabrowski y Kur., 1998, Rosano y Ceccarelli., 2014). Para la purificación de la enzima se realizó una purificación de dos pasos en un cromatógrafo Akta pure (GE). Inicialmente se realizó una cromatografía de afinidad tipo IMAC, donde se cargarán en una columna Histrap (citiva) los extractos derivados de la lisis celular de la biomasa de E. coli recolectada posterior al proceso de fermentación. Se colectan todas las fracciones para la evaluación por SDS-PAGE. Una vez confirmada la presencia de la proteína en las fracciones de elución, se realizará un segundo paso cromatográfico por exclusión de tamaño (SEC) a partir de la fracción de elución obtenida en el paso anterior y utilizando una columna HIPREP 26/10 DESALTING (Citiva). Durante este periodo del semillero 2024-1 se realizaron 3 lotes de la enzima con el fin de estandarizar los protocolos asociados a todo este proceso biotecnológico.