Tira reactiva basada en nanopartículas de carbono (CNPs) para la detección de una biomolécula modelo
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Abstract in spanish
RESUMEN: en el continuo intento porque las tiras reactivas sean un método cuantitativo, y teniendo en cuenta que la sensibilidad y rendimiento del dispositivo puede verse afectada por el reportero visual o etiqueta que se utiliza, se han propuesto tiras reactivas basadas en nanopartículas de carbono (CNPs). Lo anterior, debido a que frente a las etiquetas clásicas utilizadas como las nanopartículas de oro (AuNPs), enzimas y nanopartículas magnéticas, entre otras, las CNPs poseen características de baja toxicidad, mayor facilidad de síntesis, exposición de grupos funcionales en su superficie sin ningún pretratamiento y excelentes propiedades fluorescentes, pudiendo mejorar en gran medida la sensibilidad analítica de las tiras reactivas y ofreciendo mayores ventajas. Por tanto, en este trabajo se sintetizaron CNPs a partir de ácido cítrico (AC) y etilendiamina (EDA) usando una metodología de síntesis asistida por microondas; lo anterior, variando las proporciones en volumen de AC y EDA, y la potencia del microondas, de acuerdo con lo que indicaba un diseño experimental de mezclas previamente planteado en el software Minitab. Para confirmar la presencia de CNPs, todos los puntos del diseño experimental se caracterizaron por espectroscopia UV-Vis, espectroscopia de fluorescencia, espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), dispersión dinámica de luz (DLS) y potencial ζ. Luego para los puntos del diseño experimental de mezclas en que hubo presencia de CNPs se calculó la masa obtenida de la reacción y el rendimiento cuántico, con estos resultados y las mediciones del potencial ζ se utilizó la herramienta de optimización que brinda el software Minitab y se encontró que los valores óptimos de AC, EDA y potencia son 1,69 mL, 0,81 mL y 600 W, respectivamente. Se continuó trabajando con las CNPs del diseño experimental de mezclas sintetizadas con 1,875 mL de AC y 0,625 ml de EDA a una potencia de 600 W, ya que los valores de AC, EDA y potencia eran los más cercanos a los valores óptimos encontrados; estas CNPs tuvieron un rendimiento promedio de la reacción de 95,2 mg, un rendimiento cuántico promedio de 18,7 % y un potencial ζ promedio de -24,71 mV, además, se caracterizaron mediante micrografía electrónica de transmisión (TEM) que evidenció estructuras cristalinas con una apariencia amorfa y un tamaño menor a 10 nm. Más adelante, estas CNPs, concentradas a 1000 ppm, se conjugaron mediante el método de la carbodiimida con anticuerpos para albumina de suero bovino (anti-BSA) a una concentración final de 1 μg/mL. A continuación, los CNPs-antiBSA se inmovilizaron sobre una membrana de nitrocelulosa a través de una estrategia por adsorción y una estrategia por enlace covalente; finalmente se apagó la fluorescencia de los CNPs-antiBSA inmovilizados usando óxido de grafeno (OG) a una concentración de 25 y 50 ppm, y de esta manera se obtuvieron tiras reactivas de apagado – encendido. La tira reactiva desarrollada mantuvo su fluorescencia apagada cuando se sumergió durante 15 min en solución tampón fosfato salina (PBS) y su fluorescencia se encendió cuando se sumergió en PBS con presencia de albumina de suero bovino (BSA) a una concentración mayor a 0,1 μg/mL.
Abstract in english
ABSTRACT: in the continuous attempt to make test strips a quantitative method and considering that the sensitivity and performance of the device can be affected by the visual reporter used, test strips based on carbon nanoparticles (CNPs) have been proposed. This is because compared to classical visual reporters such as gold nanoparticles (AuNPs), enzymes, and magnetic nanoparticles, among others, CNPs have characteristics of low toxicity, easier synthesis, exposure of functional groups on their surface without any pretreatment, and excellent fluorescent properties. This can greatly improve the analytical sensitivity of test strips and offer greater advantages. Therefore, in this work, CNPs were synthesized from citric acid (CA) and ethylenediamine (EDA) using a microwave-assisted synthesis methodology. The volumes of CA and EDA, as well as the microwave power, were varied according to a previously designed mixture experimental design in Minitab software. To confirm the presence of CNPs, all points of the experimental design were characterized by UV-Vis spectroscopy, fluorescence spectroscopy, Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), dynamic light scattering (DLS), and ζ potential measurements. Then, for the points of the mixture experimental design that showed the presence of CNPs, the obtained mass of the reaction and quantum yield were calculated. Using these results and the ζ potential measurements, the optimization tool provided by Minitab software was used, and it was found that the optimal values for CA, EDA, and microwave power are 1.69 mL, 0.81 mL, and 600 W, respectively. This work continued with the CNPs from the mixture experimental design, synthesized with 1.875 mL of CA and 0.625 mL of EDA at a power of 600 W, as these values were closest to the optimal values found. These CNPs had an average reaction yield of 95.2 mg, an average quantum yield of 18.7 %, and an average zeta potential of -24.71 mV. Furthermore, they were characterized using transmission electron microscopy (TEM), which revealed crystalline structures with an amorphous appearance and a size smaller than 10 nm. Later, these CNPs, concentrated at 1000 ppm, were conjugated with antibodies for bovine serum albumin (anti-BSA) using the carbodiimide method at a final concentration of 1 μg/mL. Subsequently, the CNPs-antiBSA were immobilized onto a nitrocellulose membrane through adsorption and covalent bonding strategies. Finally, the fluorescence of the immobilized CNPs-antiBSA was quenched using graphene oxide (GO) at concentrations of 25 and 50 ppm, resulting in off – on reactive test strips. The developed test strip format maintained its quenched fluorescence when submerged in phosphate-buffered saline (PBS) for 15 minutes, and its fluorescence was restored when submerged in PBS with the presence of bovine serum albumin (BSA) at a concentration greater than 0.1 μg/mL.