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Title: Inmunosensor piezoeléctrico de alta frecuencia (100 MHz) para la detección y cuantificación de una molécula modelo
Authors: Buitrago Mejía, Laura
Adviser: Jaramillo Grajales, Marisol (Directora)
Ortiz Monsalve, Camilo
Barrientos Urdinola, Kaory
Keywords : Biosensores
Inmunosensores
Piezoeléctrico
HFF-QCM
BSA
Alta Frecuencia Fundamental
Biosensors
Immunosensors
Piezoelectric
High Fundamental Frequency
Issue Date: 2017
Publisher: Universidad EIA
Abstract: Los inmunosensores piezoeléctricos son dispositivos que detectan la formación de complejos inmunes a través del cambio en la frecuencia de resonancia o fase del cristal piezoeléctrico ocasionado por los cambios de masa en su superficie. La microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) que emplean los inmunosensores piezoeléctricos convencionales como transductor tiene una frecuencia fundamental entre 5-20MHz, sin embargo, en la actualidad se han desarrollado QCM de alta frecuencia que proporcionan mayor sensibilidad. En el presente trabajo se describe la metodología para la detección del anticuerpo anti-BSA por medio de un sensor piezoeléctrico, a partir de la inmovilización sobre electrodos de oro de cristales de cuarzo de 100 MHz (considerados de alta frecuencia) de su antígeno albumina sérica de bovino- BSA (molécula modelo). El primer paso fue determinar la concentración de biorreceptor (BSA) a inmovilizar, para lo cual se inmovilizaron tres concentraciones diferentes de BSA (10, 1 y 0.1 mg/ml) en flujo sobre el cristal de 100 MHz y se evaluaron los cambios en la fase del sensor. Para la inmovilización, se utilizaron monocapas autoensambladas mixtas (MSAM), compuestas de 11 mercapto-1undecanol (MUD) y ácido 16-mercaptohexadecanoico (MHDA), en una proporción 50:1 respectivamente, que seguidamente se activaron con EDC y NHS. La concentración que ocasionó el mayor aumento en la fase del sensor de 100 MHz fue 10 mg/ml, motivo por el cual se eligió para ser la concentración del biorreceptor. Con el fin de corroborar la inmovilización de BSA con el método utilizado sobre la superficie del cristal, se inmovilizaron esas mismas concentraciones sobre cristales de 10 MHz y se caracterizaron utilizando espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). Una vez determinada la concentración de BSA, se procedió a realizar curvas de calibración del cambio en la concentración de anti-BSA vs el cambio en la fase del sensor inmovilizando el biorreceptor mediante dos métodos, en batch y en flujo, para luego comparar cuál de los dos era el más adecuado. Las concentraciones de anti-BSA utilizadas fueron 30, 10, 1, 0.1, 0.01 µg/ml y 30, 17.3, 10, 5.7, 3.3, 1.9 µg/ml (cada una por duplicado) para las curvas con inmovilización de BSA en batch y en flujo respectivamente. La curva con inmovilización de BSA en batch mostró un límite de detección (LOD) de 0.1 µg/ml y un rango lineal entre 0.01-1 µg/ml, mientras que la curva con inmovilización de BSA en flujo mostró un LOD de 1.9 µg/ml y un rango lineal entre 1.9-5.77 µg/ml. Dada esta gran diferencia, se repitió el punto de 10 µg/ml de anti-BSA con inmovilización de BSA en flujo, esta vez utilizando alcanotioles recién preparados y la señal generada en el sensor fue de 667.5 mV, 8 veces mayor que en el primer ensayo. La caracterización con el FTIR mostró la efectividad del método utilizado al evidenciar la presencia de BSA.
Abstract (English): Piezoelectric immunosensors are devices that detect immune complex formations through the change in piezoelectric crystal resonance frequency or phase, caused by mass changes on its surface. Conventional piezoelectric immunosensors employ quartz crystal microbalances (QCM) with fundamental frequencies between 5-20 MHz, however, nowadays there have been developed high fundamental frequency quartz crystals (HFF-QCM) that provide greater sensitivity. This work describes a methodology for the detection of the antibody anti-BSA by means of a piezoelectric sensor, by the immobilization of its antigen Bovine Serum Albumin-BSA (model molecule) on the gold electrode of the 100 MHz QCM (considered as a high fundamental frequency). The first step was to determine the biorreceptor concentration (BSA) to be immobilized and for that, three different BSA concentrations (10, 1 and 0.1 mg/ml) were immobilized under flow conditions, then sensor phase shifts were measured. Mixed self-assembled monolayers (MSAM) of alkanethiolates on gold with a ratio of 50:1 were used for the immobilization process and were activated using EDC and NHS. 10 mg/ml was the BSA concentration that caused the greatest phase shift in the 100 MHz sensor, therefore it was chosen for the immobilization. In order to corroborate the immobilization of BSA on the crystal surface with the followed methodology, those same concentrations were immobilized on 10 MHz crystals and were characterized using Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). Once BSA concentration was determined, calibration curves of the anti-BSA concentration change vs phase shifts were done by two methods, BSA batch immobilization and BSA flow immobilization, in order to know which was the best one. Anti-BSA concentrations used were 30, 10, 1, 0.1, 0.01 μg/ml and 30, 17.3, 10, 5.7, 3.3 ,1.9 μg/ml (each by duplicate) for curves with BSA immobilization in batch and flow respectively. The curve with BSA batch immobilization showed a limit of detection (LOD) of 0.1 µg/ml and a linear range between 0.01-1 µg/ml, while the curve with BSA flow immobilization showed a LOD of 1.9 µg/ml and a linear range between 1.9-5.77 µg/ml. Given this big difference, the 10μg/ml point of anti-BSA was repeated immobilizing BSA in flow, this time using fresh alkanethiols and the increase in the sensor phase was 667.5 mV, 8 times bigger than the signal of the first assay. FTIR characterization showed the effectiveness of the method used showing the presence of BSA on the crystal.
Description: 66 páginas
URI: http://repository.eia.edu.co/handle/11190/1996
Citation: Buitrago Mejía, L. (2017) Inmunosensor piezoeléctrico de alta frecuencia (100 MHz) para la detección y cuantificación de una molécula modelo (Trabajo de grado). Recuperado de: http://repository.eia.edu.co/handle/11190/1996
Autorization: openAccess
Location: BIOM/0283
Appears in Collections:Ingeniería Biomédica

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