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Title: Inmovilización de sondas de ADN para un genosensor piezoeléctrico de alta frecuencia
Authors: Ortiz Monsalve, Camilo
Adviser: Jaramillo Grajales, Marisol
Keywords : Genosensor
Biosensores
Piezoeléctrico
HFF-QCM
ADN
Conjugación química
Genesensor
Biosensors
Piezoelectric
DNA
Chemical conjugation
Issue Date: 2016
Publisher: Universidad EIA
Abstract: En la actualidad la detección y análisis del ADN han tenido un particular interés, no sólo por su gran importancia en investigación sino también por la gran cantidad de aplicaciones. En respuesta a la necesidad de nuevas tecnologías de detección rápidas y sencillas surgen los biosensores. Estos pueden clasificarse según su sistema de transducción o según el evento biológico que detecten. Específicamente se le denomina genosensor a aquel dispositivo con capacidad de detectar la hibridación entre cadenas complementarias de ADN. Un genosensor piezoeléctrico es un dispositivo con capacidad de detectar la hibridación de las cadenas complementarias de ADN detectando los cambios de masa utilizando un cristal piezoeléctrico. Los cristales piezoeléctricos dan lugar a las microbalanzas de cristal de cuarzo (QCM) y es sobre este sistema transductor donde se realiza la inmovilización del biorreceptor, proceso fundamental en el desarrollo de este tipo de dispositivos. En la actualidad es posible trabajar con microbalanzas de cristal cuarzo de alta frecuencia (HFF-QCM), las cuales presentan una mayor sensibilidad que las QCM convencionales. En el presente trabajo se inmovilizaron sondas de ADN de cadena sencilla para un genosensor piezoeléctrico de alta frecuencia; se comenzó por la conjugación química del ADN mediante la adición de un grupo amino en su extremo 5’ formando un enlace fosforamidita. Este proceso incluye una etapa posterior de separación por precipitación con alcoholes. La conjugación química se evaluó inmovilizando ADN sobre cristales de 10 y 100 MHz. Este proceso de inmovilización inició con la de formación de la SAM utilizando alcanotioles, con ácidos carboxílicos como grupo funcional, seguido por la activación de los mismos mediante solución de EDC y NHS. Para los dos tipos de cristales se inmovilizó en primer lugar una molécula modelo (BSA) seguido por la inmovilización de ADN. En los cristales de 10 MHz la inmovilización se caracterizó utilizando FTIR, y en los de 100 MHz se evaluó la respuesta del biosensor en tiempo real, incluyendo la variaciones en la concentración de ADN conjugado. Posteriormente se evaluó la hibridación entre las cadenas complementarias de ADN en diferentes buffer y temperaturas, utilizando espectroscopia UV. También se analizó la respuesta del biosensor ante la hibridación. Los resultados obtenidos mediante espectroscopia ultravioleta mostraron un porcentaje de recuperación del ADN cercano al 80% con un alto grado de pureza. Adicionalmente los espectros obtenidos de los cristales de 10 MHz evidenciaron la inmovilización BSA y ADN respectivamente. En los cristales de 100 MHz el proceso de inmovilización mostró una disminución en la fase para ambas biomoléculas, que confirma la formación del enlace covalente entre la SAM activada y el analito. El análisis en el biosensor permitió establecer que la concentración de ADN a inmovilizar es 1 µM. Adicionalmente, se concluyó que la condición a utilizar para la hibridación es el buffer TB a 25 °C. Finalmente, la inyección de la cadena de ADN complementaria mostró disminución en la fase, que indica que la hibridación se dio satisfactoriamente.
Abstract (English): Nowadays, DNA detection and analysis have sparked particular interest. Not just because of its great importance in investigation, but for its great range of applications: Biosensors have emerged as a response to the need for new detection technologies that are fast and easy. There are different types of biosensors that can be classified according to the system of transduction or to the biological event detected. Devices with the ability to detect hybridization within complementary strands of DNA are specifically designated as genesensors. A piezoelectric genosensor is defined as a device with the ability to detect the hybridization of the complementary strands of DNA. It detects changes in the mass using a piezoelectric crystal. These crystals prompt quartz crystal microbalances (QCM), and it is in this transducer system where the immobilization of the bioreceptor takes place, which is a fundamental process in the development of this type of devices. Recent advances have provided the necessary foundation to work with high frequency quartz crystal microbalances (HFF-QCM), which present a greater sensibility than conventional piezoelectric systems. In this investigation, single-stranded DNA probe test were immobilized for a high frequency piezoelectric genosensor (100 MHz). The process began with the chemical conjugation of DNA by adding an amino group to its 5’ end, and consequently forming a phosphoramidite bond. This process includes a subsequent phase of separation by precipitation with alcohols. The chemical conjugation was evaluated directly by immobilizing DNA on 10 and 100 MHz crystals. This immobilization process starts with the deformation of SAM using alkanethiols with carboxylic acids as functional group, followed by their activation with EDC and NHS solutions. For the two types of crystals it was first immobilized a model molecule (BSA) and then the DNA was immobilized. With the 10 MHz crystals, the immobilization was characterized with the use of FTIR, and with the 100 MHz crystals the response of the biosensor was evaluated in real time, including the variations in the conjugated DNA concentration. In the second phase the hybridation between the complementary strands of DNA was evaluated in different buffers and temperatures using UV spectroscopy. The response of the biosensor to hybridation was also analyzed. The results obtained through UV spectroscopy showed an approximate DNA recuperation percentage of 80 % with a high degree of purity. Additionally, the spectrums obtained from the 10MHz crystals exhibited the BSA and DNA immobilization respectively. In the 100MHz crystals, the immobilization process showed a decrease in the phase for both biomolecules; this confirms the formation of a covalent bond between activated SAM and the analyte. The analysis in the biosensor enabled to establish that the DNA concentration to immobilize is 1 µM. In addition, it was concluded that the condition to be implemented is buffer TB to 25 °C. To conclude, the injection of the complementary DNA strand showed decrease in the phase, which indicates that the hybridization process was satisfactory.
Description: 77 páginas
Notes: Trabajo de grado RESTRINGIDO, desde: 25-11-2016 - hasta: 25-11-2018
URI: http://repository.eia.edu.co/handle/11190/1972
Citation: Ortiz Monsalve, C. (2016) Inmovilización de sondas de ADN para un genosensor piezoeléctrico de alta frecuencia (Trabajo de grado). Recuperado de: http://repository.eia.edu.co/handle/11190/1972
Autorization: closedAccess
Location: BIOM/0274
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