Examinando por Materia "Diferenciación celular"

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    PublicaciónAcceso abierto
    Evaluación de genes normalizadores para la cuantificación de la expresión génica en ensayos de diferenciación de células madre de médula ósea hacia el linaje osteogénico
    (Universidad EIA, 2008) García Quiroz, Felipe; López Rojas, Luis Ernesto
    RESUMEN El estudio de nuevas fuentes de células madre, así como el desarrollo de metodologías para su extracción y aplicación en terapias regenerativas y en el desarrollo de tejidos in vitro, se ha apoyado en la caracterización de su multipotencialidad. Estos ensayos se pueden realizar sometiendo las células a condiciones de diferenciación y evaluando los niveles de expresión de genes específicos de dichos procesos, para lo cual la técnica de RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) se ha convertido en una de las herramientas más utilizadas. Sin embargo, los modelos matemáticos en los que se basa la RT-qPCR exigen la validación de la estabilidad en los niveles de expresión de un gen de referencia o normalizador que permita comparar muestras bajo diferentes condiciones. En el caso de las células madre mesenquimatosas de la médula ósea humana (BMSCs), una de las líneas de células madre adultas más utilizadas, no se han publicado trabajos sobre la validación de estos genes normalizadores que permitan estudiar su diferenciación hacia el linaje osteogénico, pese a que se encuentran un buen número de estudios sobre la caracterización de dicho proceso mediante RT-qPCR. En el presente trabajo se evaluó la estabilidad en los niveles de expresión de los genes constitutivos β-actina, GAPDH y RPLI3A, para ser utilizados como genes normalizadores en ensayos de expresión génica de BMSCs bajo condiciones de diferenciación hacia el linaje osteogénico, utilizando la RT-qPCR luego de 14 y 20 días de cultivos con y sin medio osteogénico (MO), y verificando su capacidad de mineralizar la matriz extracelular. Además se cuantificaron los marcadores osteogénicos Colágeno Tipo I, Sialoproteina Ósea y Osteonectina, y se evaluaron los efectos de distintas estrategias de normalización sobre los patrones de expresión génica de estos marcadores. Los resultados confirmaron el potencial osteogénico de la línea de BMSCs establecida así como la inestabilidad del gen β-actina (p<0,0001) bajo las condiciones de diferenciación, con cambios de hasta 4,38X luego de 20 días de cultivo. La expresión de los genes GAPDH (p=0,2045) y RPLI3A (p=0,8384) no se vio afectada luego de 14 días de tratamiento con MO, aunque al día 20 se observaron cambios mínimos, con variabilidades máximas inferiores a 2X. El gen RPLI3A mostró menor variabilidad que el GAPDH, al analizar los niveles de expresión en función del tiempo de tratamiento con MO. Lo anterior se confirmó con los patrones de expresión de los marcadores osteogénicos, donde sólo RPLI3A permitió obtener un patrón de expresión consistente con el proceso de diferenciación celular observado. En conclusión, los resultados de este trabajo sugieren la necesidad de replantear los estudios donde se han utilizado los genes β-actina y GAPDH como normalizadores. De igual manera, es necesario informar a la comunidad científica sobre la importancia de la validación de los genes normalizadores utilizados en los ensayos de RT-qPCR para la caracterización de estos procesos de diferenciación celular.
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    PublicaciónAcceso abierto
    Obtención y diferenciación osteogénica de células madre de la bolsa de bichat
    (Universidad EIA, 2019) Ceballos Santa, María Camila; Londoño Peláez, Carolina
    A lo largo de las últimas décadas se ha optado por el uso y la aplicación de células madre en terapias de medicina moderna para tratamientos de diferentes enfermedades. Para ello, los esfuerzos investigativos se enfocan en el aislamiento de las células madre adultas, ya que están presentes en múltiples tejidos, forman parte del proceso natural de regeneración y han demostrado su multipotencialidad para diferenciarse a diversas líneas celulares especializadas al ser cultivadas in vitro. Los avances más recientes se han concentrado en identificarlas de la bolsa de Bichat, una masa adiposa encapsulada ubicada en la cavidad oral y de fácil acceso en cirugías maxilofaciales. Dichos estudios sostienen que esta fuente contiene células madre mesenquimales, las cuales se caracterizan por su capacidad de diferenciación a osteocitos, adipocitos, condrocitos y miocitos, como también a células de origen neural, hepático y renal. Por otra parte, afirman que además poseen la capacidad de autorenovarse con una alta tasa de proliferación. Con base en estos estudios previos y con el fin de analizar el comportamiento morfológico y la capacidad de proliferación bajo parámetros controlados, se aislaron células madre del tejido adiposo de las bolsas de Bichat y se preservaron en el tiempo hasta lograr una alta confluencia del cultivo. Adicionalmente, se evaluó la viabilidad celular por medio de los ensayos MTT y azul de tripano posterior a una criopreservación en nitrógeno líquido, tanto en estos cultivos como en los controles que no experimentaron las condiciones extremas de temperatura. Finalmente, las células fueron inducidas a diferenciación osteogénica y se detectó el inicio de la osteogénesis mediante una detección temprana de depósitos de calcio, los cuales fueron caracterizados de manera cualitativa con la tinción de alizarina roja.