ESFERAS BASADAS EN ALGINATO, GELATINA Y POLIVINIL ALCOHOL CON POTENCIAL APLICACIÓN EN EL CULTIVO DE CONDROCITOS Modalidad: Exploratorio KAREN GISELLA LENIS ARIAS Trabajo de grado para optar al título de Ingeniería Biomédica Director Claudia Elena Echeverri Cuartas Co-director Yesid de Jesús Montoya Góez UNIVERSIDAD EIA INGENIERÍA BIOMÉDICA ENVIGADO 2021 “A mis padres y familiares, que estuvieron conmigo durante todo el proceso de formación y confiaron en mi”. AGRADECIMIENTOS Agradezco a todas aquellas personas que confiaron y estuvieron conmigo durante todo el proceso de formación como persona y profesional, a mi padre que fomento la disciplina y dedicación, a mis docentes Claudia Elena Echeverri y Yesid Montoya por guiarme y compartir sus conocimientos, ya que fue de vital importancia para lograr llevar a cabo este trabajo, a Frank por apoyarme y a mi madre por ser mi soporte en esta etapa de aprendizaje. CONTENIDO pág. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 9 PRELIMINARES ....................................................................................................... 10 1.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA .................................................................... 10 1.2 OBJETIVOS DEL PROYECTO .......................................................................... 11 1.3 MARCO DE REFERENCIA ................................................................................ 11 METODOLOGÍA ....................................................................................................... 20 2.1 DISEÑO EXPERIMENTAL ................................................................................. 20 2.2 DESARROLLO DEL EXPERIMENTO ................................................................ 21 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS .............................................. 24 3.1 ESFERAS DE ALG/GEL/PVA CON SUS DIFERENTES TRATAMIENTOS ........ 24 3.2 PROPIEDADES MECÁNICAS Y ESFÉRICAS DE LAS MUESTRAS RESULTANTES ........................................................................................................... 26 3.3 EFECTO MECÁNICO DE LA FORMA DE LA PROBETA ................................... 31 3.4 EFECTO DEL MATERIAL EN LA RESISTENCIA ............................................... 40 CONCLUSIONES Y CONSIDERACIONES FINALES .............................................. 43 REFERENCIAS ............................................................................................................... 44 LISTA DE TABLAS Tabla 1. Diseño experimental preliminar .......................................................................... 20 Tabla 2. Tratamientos derivados del diseño preliminar .................................................... 20 Tabla 3. Volumen de las muestras según su proporción .................................................. 21 Tabla 4. Relación de forma de Zingg ............................................................................... 23 Tabla 5. Tratamientos seleccionados ............................................................................... 25 Tabla 6. Resultados de los ensayos entregados por la INSTRON ................................... 27 Tabla 7. Forma según la relación de forma de Zingg ....................................................... 30 Tabla 8 Tratamientos con su volumen para las simulaciones .......................................... 31 Tabla 9 Dimensiones de las figuras geométricas modeladas ........................................... 33 Tabla 10. Resultado del análisis de sensibilidad de la malla ............................................ 35 Tabla 11. Esfuerzos máximos de compresión según la geometría y tratamiento ............. 39 Tabla 12. Resultado de esfuerzo máximo en esferas experimentales .............................. 41 Tabla 13 Esfuerzos máximos y geometrías ..................................................................... 41 LISTA DE FIGURAS Ilustración 1. Representación gráfica del cartílago hialino articular y su entorno .............. 13 Ilustración 2. División del cartílago en sus respectivas zonas que lo caracterizan y le brindan las propiedades mecánicas ................................................................................. 13 Ilustración 3. Representación esquemática de la estructura del alginato con ácido manurónico (M) y glucorónico (G) (Volker83, 2008) ......................................................... 16 Ilustración 4. Estructura química de la gelatina ................................................................ 17 Ilustración 5. Estructura química del PVA (Jesse, 2005) .................................................. 18 Ilustración 6. Preparación de esferas de Alg-Gel-PVA ..................................................... 22 Ilustración 7. Relación de ejes a y b ................................................................................. 23 Ilustración 8. geometrías modeladas mediante Fusión 360 ............................................. 23 Ilustración 9. Tratamientos con mayor porcentaje de Gelatina ......................................... 24 Ilustración 10. Morfologías obtenidas con los tratamientos 4 y 5 ..................................... 25 Ilustración 11. Estructura de las mezclas de Alg/Gel/PVA seleccionadas ........................ 26 Ilustración 12. Grafico de carga vs desplazamiento de los tratamientos .......................... 28 Ilustración 13. Gráfico de la curva esfuerzo vs deformación de los tratamientos 1,2,7 y 8, respectivamente .............................................................................................................. 29 Ilustración 14 Prisma rectangular sus dimensiones fijas y variables ................................ 32 Ilustración 15 Volumen del cilindro a usar con altura fija y radio variables ....................... 32 Ilustración 16. Representación gráfica de las dimensiones usadas para hallar el volumen de la geometría cúbica ..................................................................................................... 33 Ilustración 17. Requerimientos de diseño para llevar a cabo la simulación según el tratamiento ....................................................................................................................... 33 Ilustración 18. Geometrías diseñadas con su enmallado ................................................. 36 Ilustración 19. Distribución del esfuerzo a compresión en el prisma rectangular usando escala de colores ............................................................................................................. 37 Ilustración 20. Resultado de la simulación de la geometría cubica donde se muestra el máximo esfuerzo a compresión y el interior de la figura mediante corte transversal y punto de máximo esfuerzo......................................................................................................... 38 Ilustración 21. Geometría cilíndrica sometida a esfuerzo de compresión ......................... 38 RESUMEN La ingeniería de tejido cartilaginoso ha tomado relevancia a través del tiempo, debido a que las enfermedades degenerativas como la artrosis afectan este tejido y están en constante aumento a nivel mundial, lo cual pone en peligro el bienestar de la población. Lo anterior ha motivado a muchos investigadores a buscar soluciones ante esta problemática, por medio del desarrollo de andamios hechos de materiales poliméricos con geometrías esféricas. Sin embargo, aunque estas mezclas de polímeros han resultado viables en el cultivo de condrocitos, aún se encuentra en estudio una composición de biomateriales que sea capaz de soportar las cargas mecánicas del cartílago y ayuden a la regeneración del mismo. Considerando la importancia de esta aplicación, en este trabajo se fabricaron microesferas con diferentes proporciones de polímeros naturales, como alginato (Alg) y gelatina (Gel), que fueron combinados con el polímero sintético, polivinil alcohol (PVA). La elección de estos materiales se realizó debido a las buenas propiedades mecánicas y biológicas para aplicaciones relacionadas con la ingeniería de tejidos; en particular, las propiedades mecánicas se evaluaron mediante un ensayo que permite identificar la resistencia a compresión, siendo uno de los esfuerzos que realiza el cartílago en su funcionamiento cotidiano y al cual está expuesto constantemente el condrocito. Así mismo, con el fin de comparar las esferas experimentales con otros andamios posibles se modelan por medio de CAD y se evalúan mediante un software de análisis de elementos finitos otras geometrías usadas en la ingeniería de tejidos como la cúbica, la cilíndrica y la prismática rectangular, las cuales se usaron para establecer la mejor geometría y método de fabricación mediante un ensayo de esfuerzo a compresión simulado, teniendo en cuenta las propiedades mecánicas del material. Finalmente, se hizo un estudio de mecánica de contacto para establecer el esfuerzo máximo de las esferas fabricadas en el laboratorio, los cuales una vez fueron comparados con los esfuerzos de las simulaciones, esta comparación dio como resultado que las geometría más viables mecánicamente son la prismática rectangular y la esférica, ya que poseen un esfuerzo máximo de compresión más bajo respecto a las otras, sin embargo, no solo se debe tener en cuenta dichas propiedades mecánicas, puesto que se debe garantizar una relación entre la matriz y el condrocito para lograr así una mimetización en el tejido cartilaginoso, es por esto que siendo el condrocito una celular de morfología esférica se plantea que el mejor andamio son las esferas experimentales más específicamente las del tratamiento N° 8 las cuales se fabricaron con una proporción de 10 % de Gel sobre la mezcla de 80 % Alg y 10 % PVA. ABSTRACT Cartilage tissue engineering has gained relevance over time because degenerative diseases such as osteoarthritis affect this tissue and are constantly increasing worldwide, which endangers the well-being of the population. This has motivated many researchers to seek solutions to this problem, through the development of scaffolds made of polymeric materials with spherical geometries. However, although these polymer mixtures have proven viable in the cultivation of chondrocytes, a composition of biomaterials that can support the mechanical loads of cartilage and helping to regenerate it is still under study. Considering the importance of this application, in this work microspheres were manufactured with different proportions of natural polymers, such as alginate (Alg) and gelatin (Gel), which were combined with the synthetic polymer, polyvinyl alcohol (PVA). The choice of these materials was made due to the good mechanical and biological properties for applications related to tissue engineering; in particular, the mechanical properties were evaluated by means of a test that allows to identify the resistance to compression, being one of the efforts made by the cartilage in its daily functioning and to which the chondrocyte is constantly exposed. Likewise, in order to compare the experimental spheres with other possible scaffolds, other geometries used in tissue engineering such as cubic, cylindrical and rectangular prismatic are evaluated by means of CAD and evaluated using finite element analysis software, which were used to establish the best geometry and manufacturing method through a simulated compressive stress test, considering the mechanical properties of the material. Finally, a contact mechanics study was made to establish the maximum stress of the spheres manufactured in the laboratory, which were once compared with the stresses of the simulations, this comparison resulted in the prismatic geometry being the most mechanically viable. rectangular and spherical, since they have a lower maximum compression stress compared to the others, however, not only these mechanical properties must be taken into account, since a relationship between the matrix and the chondrocyte must be guaranteed to achieve this a mimicry in the cartilaginous tissue, which is why the chondrocyte being a cell with spherical morphology, it is suggested that the best scaffold are the experimental spheres, more specifically those of treatment No. 8, which were manufactured with a proportion of 10% of Gel on the mixture of 80% Alg and 10% PVA. INTRODUCCIÓN Enfermedades como la artrosis cada vez cobran más importancia en la salud pública, ya que, provoca una pérdida considerable del cartílago y propiedades fisiológicas de este. Por otra parte, articulaciones como las rodillas son las más afectadas debido a la exposición constante a lesiones, induciendo así pérdida progresiva de tejido cartilaginoso (Vinatier & Guicheux, 2016; Yeung et al., 2019). Por tal motivo, científicos e investigadores han visto la necesidad de aportar mejores soluciones al problema existente mediante la ingeniera de tejidos cartilaginoso, la cual relaciona el cultivo de las células y el andamio con el fin de reparar la zona afectada de manera satisfactoria, sin embargo, aún no se ha establecido una interfaz funcional adecuada, debido a la mala integración de esta en la reparación del cartílago y la diferenciación del condrocito (Li et al., 2020). Algunos estudios han revelado la importancia de la interacción mecánica en el metabolismo y actividad celular del condrocito, siendo los andamios tridimensionales fabricados en forma de microesferas los más usados en la ingeniería de tejidos cartilaginoso, ya que generan un ambiente biomimético y poseen una densidad más baja, con respecto a otros andamios, lo cual lo hace comparable con el cartílago nativo (Yeung et al., 2019). Estos andamios suelen fabricarse con polímeros naturales y sintéticos tales como el colágeno, gelatina, alginato y PVA, ya que cuentan con características de biocompatibilidad, adhesión celular, resistencia mecánica, absorción de agua y biodegradación. Sin embargo, la mayoría de estos andamios poliméricos no tienen buena resistencia mecánica y respuesta biológica que permita la diferenciación de condrocitos (Li et al., 2020; Rodrigues et al., 2012; Silva et al., 2018). Dicho lo anterior, en este trabajo exploratorio se prepararon esferas mediante una mezcla alginato, gelatina y PVA, con el fin de evaluar sus propiedades mecánicas, las cuales fueron comparadas con otras geometrías como la cilíndrica, cubica y prismática. Estas últimas, se simularon haciendo uso de modelado computacional y análisis de elementos finitos, para determinar cuál podría ser la mejor geometría para fabricar este tipo de estructuras. Lo anterior, tenía como finalidad determinar las condiciones de formación de las microesferas, y evaluar la geometría del biomaterial para que cumpliera con las propiedades mecánicas del cartílago al evaluarlo bajo fuerzas de compresión, para garantizar así su posible aplicación en el cultivo de condrocitos. PRELIMINARES 1.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA El cartílago hialino articular es un tipo de tejido conectivo, el cual mediante sus propiedades mecánicas sirve al cuerpo como amortiguador de cargas; sin embargo, su capacidad para regenerarse una vez este dañado es muy poca, siendo el deporte y las enfermedades como la osteoartritis, algunas de las principales razones de una rápida degeneración del cartílago (Rodriguez-Fontan et al., 2016). La osteoartritis (OA) es una de las enfermedades articulares degenerativas más común en el mundo y también es una de las causantes de discapacidad laboral (Friól et al., 2012), esta enfermedad surge debido a un deterioro del cartílago articular ya que al sufrir lesiones constantes se genera en él un cambio de su estructura original, alterando el hueso subcondral y la membrana sinovial, al mismo tiempo que aumenta la fricción entre las superficies óseas (Giménez et al., 2006; Rodríguez-Camacho & Correa-Mesa, 2018). Dado que el cartílago no posee terminaciones nerviosas, la osteoartritis en fase temprana es asintomática, lo cual indica que una vez se comienzan a detectar ya es tarde, puesto que el daño a nivel condral ya es avanzado (Zapata et al., 2007). De lo anterior, se han planteado tratamientos como la microfractura, implantación de condrocitos autólogos y la implantación de condrocitos autólogos inducida por matriz (Francis et al., 2018). Sin embargo, la regeneración del cartílago articular sigue siendo uno de los retos hasta el día de hoy, lo cual ha dado pie al surgimiento de la ingeniería de tejido cartilaginoso, ya que esta ciencia plantea el uso de células y matrices (Liu et al., 2017), las cuales deben ser biocompatibles, biodegradables y con propiedades mecánicas. Uno de los materiales que se ha propuesto como una alternativa en este tipo de aplicaciones es el alginato, ya que este biomaterial cumple al ser biodegradable y biocompatible, además de no desencadenar una reacción de antígenos y contener una capacidad quelante (Farokhi et al., 2019; Silva et al., 2018), no obstante, por sí solo, sus propiedades mecánicas no son comparables con las del cartílago articular original, ya que este se encuentra constantemente sometido a esfuerzos de tracción, compresión y regula la fricción entre sus superficies (Rodríguez-Camacho & Correa-Mesa, 2018). Por otra parte, se han diseñado hidrogeles compuestos por proteínas como el colágeno y la gelatina, los cuales han demostrado ser favorables a nivel celular, ya que permiten la diferenciación de condrocitos y, a corto plazo, dio resultados muy esperanzadores; sin embargo, a largo plazo, este tipo de andamio promovió la formación de quistes en el hueso subcondral debido a que este material no es bueno soportando cargas (Spiller et al., 2011); del mismo modo, se han probado biomateriales sintéticos como el polivinalcohol o PVA el cual cuenta con las propiedades mecánicas del cartílago articular teniendo valores muy similares en esfuerzos a tracción y cizalladura, al mismo tiempo que cumple con propiedades de permeabilidad, lubricación y coeficientes de fricción equivalentes; sin embargo, tanto el PVA, como el colágeno y el alginato no cumplen con todas las características que una matriz tridimensional debe tener en esta aplicación de ingeniería de tejidos (Spiller et al., 2011). Es por ello por lo que se deben diseñar matrices de cultivo que garanticen la proliferación y supervivencia de los condrocitos, teniendo en cuenta las propiedades mecánicas y porosidad, haciendo uso del alginato, la gelatina y el PVA como biomateriales para el diseño del andamio tridimensional, ¿qué características tiene la mezcla polimérica de alginato-gelatina-PVA que conducen a la formación de una matriz 3D para el cultivo de condrocitos? 1.2 OBJETIVOS DEL PROYECTO 1.2.1 Objetivo general Obtener esferas basadas en la mezcla de alginato, gelatina y polivinalcohol con potencial aplicación en la ingeniería del tejido cartilaginoso. 1.2.2 Objetivos específicos • Proponer un protocolo que permita la obtención de esferas de alginato, gelatina y PVA para su aplicación como andamio para el crecimiento de condrocitos. • Identificar las condiciones de mezcla que conducen a la obtención de esferas con las propiedades mecánicas y esfericidad requeridas para el cultivo de condrocitos. • Proponer un modelo a partir de las propiedades mecánicas evaluadas para la selección de las condiciones de fabricación según los requerimientos de cultivo de condrocitos. 1.3 MARCO DE REFERENCIA 1.3.1 Antecedentes • Investigadores como Lily Jeng et al. (Jeng et al., 2013) construyeron andamios cartilaginosos compuestos de colágenos tipo II y sembraron en ellos condrocitos caprinos, para ello aislaron condrocitos autólogos los cuales fueron incubados y posteriormente fueron cultivados. Finalmente, en los resultados, se pudo observar que la lámina de colágeno tipo IV en los andamios modificados in vitro, muestra reparación de cartílago in vivo en el lugar donde se realizaron los implantes. De este estudio, a pesar de los hallazgos, se concluyó que se necesita trabajo futuro para dilucidar el papel de las moléculas de la membrana basal durante la reparación y regeneración del cartílago. • El estudio realizado por Raquel Silva y colaboradores denominado: “Tissue- Hydrogel matrices based on elastin and alginate for tissue engineering applications” (Silva et al., 2018).se describe la producción y caracterización de nuevos hidrogeles híbridos, compuestos de alginato (Alg) mezclado con elastina (E) del ligamento de cuello bovino. El resultado indica que un hidrogel hibrido como Alg/E puede ayudar a regenerar tejidos blandos y servir de base para andamios más complejos, sin embargo, se requiere un análisis más profundo de las interacciones celulares con matrices en 2D y 3D. • El artículo, “A high-toughness and high cell adhesion polyvinyl alcohol PVA- hyaluronic acid (HA)-human-like collagen (HLC) composite hydrogel for cartilage repair” el cual fue realizado por Jiaheng Xie y Daidi Fan, propone un hidrogel de PVA, ácido hialurónico (HA) y colágeno similar al humano (HCL). Siendo este último una proteína modificada genéticamente producida por E. coli BL21. De lo anterior se concluyó que, el hidrogel contenía una porosidad del 94,52%, una deformación de compresión máxima del 90% y una resistencia a compresión de 5,56 MPa; además, se comprobó que dicho hidrogel reparaba defectos del cartílago, es decir, este tipo de hidrogeles pueden usarse como andamios para reparar cartílago (Xie & Fan, 2020). • En el artículo “Analysis and Demonstration of a Scaffold Finite Element Model for Cartilage Tissue Engineering” realizado por Kain Sun, Ruixin Li, Hui Li, Meng Fan y Hao Li, se presenta un modelo tridimensional de cartílago, el cual fue evaluado por medio de elementos finitos para explorar el comportamiento mecánico del área reparada bajo una carga de compresión fisiológica. Para lograr lo anterior, evalúan los efectos de diferentes tipos defectos del cartílago (formas circulares o rectangulares y apilamiento vertical o inclinado) y los parámetros de los andamios de cartílago artificial sobre el comportamiento mecánico del área. Con el fin de conocer el comportamiento del área reparada expuesta a una carga de compresión, las geometrías fueron elaboradas y se les probaron sus propiedades físicas y biomecánicas. En conclusión, la geometría circular vertical obtuvo mejores resultados frente al cultivo de condrocitos (Li et al., 2020). Teniendo en cuenta los avances obtenidos de los antecedentes, es claro que se debe optar por seguir estudiando por las opciones más favorables, pues hay un gran potencial en estos polímeros, pensado en un futuro próximo, lo cual a su vez podría llevar al desarrollo de una solución a la problemática expuesta previamente. 1.3.2 Cartílago hialino El cartílago hace parte de los tejidos conectivos y suele estar presente en partes donde se requiera flexibilidad. Ahora bien, está compuesto de células y fibras de colágeno tipo II, proteoglicanos y ácido hialurónico el cual se encuentra en superficies articulares del hueso, paredes del sistema respiratorio y placas epifisarias (Brelje & Sorenson, 2015). Así mismo, son las fibras las encargadas de resistir fuerzas a tracción y compresión a las que somete el tejido. Sin embargo, este tejido no cuenta con irrigación ni nervios, por lo que su lubricación se lleva a cabo por medio de la membrana sinovial que recubre la articulación (Ilustración 1), además su matriz extracelular esta mayormente compuesta por redes de cartílago tipo II, el cual sirve como soporte ante la constante distribución de cargas, estas se llevan a cabo si los condrocitos están funcionando correctamente. Dado que una de las funciones más destacadas del cartílago es la capacidad de disipar fuerzas y reducir la fricción, se dice que es un tejido que se adapta a la mecano-destrucción, lo que lo hace capaz de convertir la fuerza física en respuesta biológica, con el fin de mantener el tejido. Esta mecano destrucción del cartílago varía según la zona donde se estimule, ya que el cartílago al contar con tres capas pueden moldearse según la profundidad del esfuerzo mecánico aplicado (Rodríguez-Camacho & Correa-Mesa, 2018; Spiller et al., 2011). Ilustración 1. Representación gráfica del cartílago hialino articular y su entorno A. Estructura del cartílago hialino Estructuralmente, el cartílago articular cambia su conformación dependiendo de qué tan profundo es el tejido, esto se da debido a que cuenta con cuatro zonas, las cuales son: la zona superficial, zona media, zona profunda y zona calcificada (Ilustración 2). Dicho esto, la zona superficial sirve como protección a las capas más profundas de esfuerzo cortantes, ya que gracias a la ubicación paralela de las fibras de colágeno posee una alta densidad, además, cuenta con un gran número de condrocitos y es el principal contacto con el líquido sinovial. Por otro lado, la zona media funciona como transición y representa al rededor del 40 a 60 % del volumen del cartílago, se encuentra conformada por condrocitos esféricos, los cuales están en una red de fibras de colágenos más gruesas y desordenadas, así mismo, esta zona se encarga de proporcionar resistencia a las fuerzas de compresión. De igual manera, la zona profunda cuenta con condrocitos de mayor tamaño, los cuales se encuentran rodeados por colágeno tipo VI, a su vez que, contiene más proteoglicanos y menos concentración de agua comparado con el tejido en sí. Por último, se tiene la zona calcificada, esta recibe su nombre debido a que es el límite entre el tejido cartilaginoso y el hueso subcondral y está compuesta por glicosoaminoglicanos y glicoproteínas (Armiento et al., 2018; Rodríguez-Camacho & Correa-Mesa, 2018). Ilustración 2. División del cartílago en sus respectivas zonas que lo caracterizan y le brindan las propiedades mecánicas B. Condrocitos Los condrocitos son las principales células que conforman la matriz extracelular del cartílago articular y se derivan de las células madre mesenquimales. Sin embargo, su forma varía según el área donde se encuentre, es decir, aquellas que estén ubicadas en la zona superficial tienden a ser más planas y tienen una mayor densidad con respecto a las que se encuentran ubicadas en zonas más profundas. Del mismo modo, su membrana plasmática es rica y diversa en proteínas, por lo cual recibe el nombre de membranoma y es de suma importancia para el funcionamiento de los condrocitos (Fox et al., 2009; Mobasheri et al., 2019). A su vez, los condrocitos se ubican en cavidades de la matriz conformando entre el 5 y el 10 % del volumen del cartílago y se encargan de brindar soporte estructural, resistir las deformaciones y fuerzas que allí se aplican, por lo cual se le atribuye el nombre de mecano-sensible. Cabe agregar que, los condrocitos también se encargan del metabolismo de la matriz extracelular, estabilizando tanto su estructura como el medio que la rodea (Phull et al., 2016). C. Matriz extracelular del cartílago Una matriz extracelular, es aquella que ayuda a dar soporte y conformar una estructura para las células y tejidos, esto mediante comunicaciones adherentes y focales entre células. Por consiguiente, en el caso del cartílago articular, la matriz extracelular (MEC) está compuesta por condrocitos los cuales pueden ser redondos, ovalados o aplanados, donde su morfología depende de la edad de la persona y la zona de la matriz. Así mismo, esta última constituye cerca del 95 % del volumen del cartílago y contiene entre 60-80 % de agua o liquido tisular, además de poseer 15 % de colágenos tipo II, VI, IX, X y XI y cerca del 9 % de proteoglicanos (Vaca-González et al., 2017). De igual manera, la MEC del cartílago cuenta con la capacidad de retener grandes cantidades de agua, esto se relaciona con la principal función del tejido, la cual es permitir la movilidad del cartílago sin poseer fricción y compensar el impacto de las fuerzas compresivas que se aplican en la articulación (Martínez-Moreno et al., 2019). Teniendo en cuenta que la matriz extracelular es la que le da soporte a la estructura, es importante identificar las propiedades mecánicas del cartílago, puesto que las cargas a compresión pueden conllevar a deformaciones al interior de la matriz, lo que lleva a responder con un aumento de presión del líquido sinovial (Rodríguez-Camacho & Correa- Mesa, 2018). Por consiguiente, estas cargas suelen presentarse en la zona superficial del cartílago haciendo que su módulo de Young sea más bajo, soportando así más deformación que en su interior, donde es frágil y de fácil rotura. Dicho esto último, se establece que el cartílago posee un módulo de Young alrededor de 0,35 MPa a 0,80 MPa (Hombre, 2012; Moshtagh, 2017; Rodríguez-Camacho & Correa-Mesa, 2018), y puede considerarse como un material elástico, ya que posee la capacidad de recuperar su forma, lo cual ha sido reportado en un estudio de cartílago humano (Griffin et al., 2016). D. Agua Es el principal componente del cartílago articular y comprende el 80 % de él. El agua sirve como medio de transporte de nutrientes y ayuda a la lubricación de los condrocitos y del cartílago, en general. Alrededor del 30 % se encuentre en el espacio interfibrilar dentro del colágeno, sin embargo, la concentración de este componente disminuye del 80 % al 65 % en la zona profunda del cartílago. También se debe resaltar que el cartílago es capaz de soportar cargas significativas debido a la resistencia por fricción al flujo de agua y a la presurización de esta dentro de la matriz extracelular, sin embargo, es de aclarar que, en muchas ocasiones, varían ya que dependen del peso corporal de la persona (Buckwalter & Mankin, 1998; Fox et al., 2009). E. Colágeno Esta proteína conforma gran parte del cartílago hialino en peso, siendo el colágeno tipo II el más abundante en la matriz extracelular, ya que representa el 90 % del contenido. También están presentes otros tipos de colágeno, pero en menor proporción. El colágeno es una proteína fibrilar, es decir, su forma posee fibrillas entrelazadas entre sí y su alineación está muy ligada a la dirección de las cargas que debe soportar el cartílago, lo cual hace que le dé mayor rigidez; (Martínez-Moreno et al., 2019; Vaca-González et al., 2017). 1.3.3 Ingeniería de tejido cartilaginoso (ITC) En general, la ingeniería de tejido cartilaginoso involucra principalmente la regeneración del tejido mediante el empleo de biomateriales, células vivas y factores de crecimiento (Zhang et al., 2019), por lo que ha tenido gran auge debido al impacto de sus aplicaciones, en las que se ofrecen diversos tratamientos a patologías, en este caso, aquellas relacionadas con el cartílago. En este orden de ideas, la ingeniería del tejido cartilaginoso es una estrategia de regeneración que incluye: a las células, las cuales deben ser capaces de conformar una matriz; los factores de crecimiento, los cuales ayudarán a la diferenciación celular y la construcción de andamios, que cumplan con propiedades de simulación del ambiente mecánico (Vinatier & Guicheux, 2016). Dicho esto, se debe aclarar que la creación de andamios tridimensionales favorece la proliferación de condrocitos, siendo el principal objetivo de esta ciencia, diseñar una estructura similar a la nativa. Es por ello por lo que, dichos andamios deben ser capaces de permitir la proliferación y crecimiento celular, al mismo tiempo de contar con propiedades mecánicas parecidas al cartílago hialino original, y así ser capaz de mimetizarse en el entorno natural de la MEC (Zhang et al., 2019). Por consiguiente, un andamio para la reparación del cartílago debe permitir el crecimiento y la proliferación de condrocitos, permitir el libre movimiento de estas células a lo largo de su estructura y exhibir propiedades mecánicas complejas, ya que de esta forma se proporciona un entorno biológico adecuado al cartílago hialino nativo (Armiento et al., 2018; Campos et al., 2018). 1.3.4 Biomateriales usados para ingeniería del tejido cartilaginoso Un biomaterial es, aquel material diseñado con una forma específica capaz de generar una respuesta adecuada en el tejido anfitrión, para la aplicación que se requiera (Quadros et al., 2021). Así mismo, facilitan la proliferación y diferenciación celular, lo cual permite la conformación de una matriz y una correcta integración con el tejido (Pasillas, 2019), el cual independientemente del tipo debe conservar las propiedades fundamentales de un biomaterial, las cuales son: biocompatibilidad, biodegradación, permeabilidad y propiedades mecánicas según la aplicación (Armiento et al., 2018). El uso de biomateriales en la ingeniería de tejidos es fundamental, por lo tanto, para hacer la selección del material es importante las propiedades mecánicas, ya que estas deben ser similares al tejido que se desea reemplazar o modificar, y, así mismo, se debe tener en cuenta la forma y función del tejido (Hudecki et al., 2018). Teniendo en cuenta lo anterior, se plantea el uso de biomateriales naturales y sintéticos que ya han sido utilizados en la ingeniería de regeneración de cartílago, como lo son el alginato, el cual es un polímero de origen natural, la gelatina que es un derivado del colágeno, el cual es el principal componente del cartílago y el polivinil alcohol, que es sintético y que puede aportar propiedades mecánicas suficientes para la aplicación. A. Alginato Es un polisacárido aniónico de origen natural, el cual no se encuentra ramificado y es sintetizado a partir de algas pardas, así mismo, es un material hidrófilo, es decir, que posee la capacidad de absorber agua, lo cual representa un beneficio para el crecimiento celular. De igual forma, el alginato posee capacidad de biodegradación, bajo costo, fácil acceso y biocompatibilidad, lo cual lo transforma en un biomaterial apropiado para aplicaciones de ingeniería de tejido cartilaginoso (Farokhi et al., 2019; Hu et al., 2021). Por otro lado, el alginato cuenta con una propiedad funcional importante, la cual es la gelificación inducida, es decir, realiza la formación de geles mediante iones por interacciones electroestáticas de las moléculas, que se encuentran cargadas negativa y positivamente, constituyendo así un complejo poli electrolítico. Además, esto suele realizarse por medio de Ca2+ en donde se obtiene un gel fácil de fabricar, no toxico y seguro. De este modo, la gelificación del alginato se pueden obtener usando CaCl2, el cual mediante método exógeno genera una estructura de gel no homogénea, para ello solo se debe dejar caer el polímero en la solución de CaCl2, donde al interactuar con el Ca2+ genera una rápida gelificación (Hu et al., 2021). Este material está conformado por copolímeros no ramificados de ácido β-D- manurónico (M) y α-L-gulurónico (G), unidos a través de enlaces glicosídicos β(1→4) tal como se muestra en Ilustración 3, además de poseer una temperatura de transición vítrea de 102 °C (Moreno, 2013). Ilustración 3. Representación esquemática de la estructura del alginato con ácido manurónico (M) y glucorónico (G) (Volker83, 2008) Ahora bien, estudios realizados por investigadores, aislaron condrocitos nasales de conejos y los expandieron en un cultivo de gel de alginato en monocapa y 3d, estableciendo que, aquellas células que estaban en el andamio tridimensional obtuvieron una proliferación más rápida y un resultado in vivo similar al tejido cartilaginoso, esto indica que el uso de alginato es prometedor para la aplicación de regeneración de cartílago, sin embargo, sus propiedades de adhesión, migración y viabilidad no resultan ser muy buenas, por lo que se puede abordar agregando gelatina al alginato (Farokhi et al., 2019; Xu et al., 2019). Por último, la literatura indica que existen dos células madre prometedoras para el uso de la reparación del tejido cartilaginoso, estas son: las células madres mesenquimales y las células madre embrionarios o pluripotentes inducidas, que requieren de micropartículas para ser suministradas (Farokhi et al., 2019), las cuales son de fácil producción y manipulación para la diferenciación condrogénica (Xu et al., 2019). B. Gelatina La gelatina es una proteína insoluble que resulta de la hidrólisis del colágeno nativo o colágeno tipo II no hidrolizado, la cual posee una composición molecular parecida al colágeno nativo, debido a la capacidad de realizar las mismas funciones que el colágeno en desarrollos celulares que requieran biomateriales (Bello et al., 2020). Dicho lo anterior, la gelatina se ha convertido en los últimos años en un material de interés para la ingeniería regenerativa, ya que, tiene la capacidad de adoptar características similares a la matriz extracelular nativa del tejido, es biocompatible, biodegradable, no tóxico, de fácil acceso, y fácil modificación con otro biomaterial o molécula (Afewerki et al., 2019; Han et al., 2014).A continuación la Ilustración 4 representa una estructura química básica de la gelatina. Ilustración 4. Estructura química de la gelatina De igual forma, la gelatina dependiendo del proceso de obtención se clasifica en tipo A (acido) o tipo B (básico) (Narayanaswamy et al., 2016). Lo cual afecta las propiedades fisicoquímicas como la capacidad gelificante, el punto isoeléctrico, temperatura de transición vítrea y pH. Para el caso de la gelatina tipo A esta tiene una temperatura de transición vítrea de 44,19 °C (Asma et al., 2014), una alta capacidad gelificante en donde su punto isoeléctrico esta entre 8-9 y cuenta con carga positiva a pH neutro, mientras que la gelatina tipo B tiene una temperatura de transición de aproximadamente 30 °C, con punto isoeléctrico entre 4,8 - 5,4 y cuenta con carga negativa a pH neutro (Afewerki et al., 2019; Tseretely & Smirnova, 1992). Lo anterior, debe considerarse cuidadosamente, ya que estas propiedades influyen en las interacciones con otros polímeros como el alginato, donde el estudio realizado por Yafei y colaboradores encontró que, la gelatina tipo A presenta dificultad a la hora de producir microesferas con alginato, mientras que la gelatina tipo B tubo mayor tasa de existo en la construcción de estas, siendo capaz de efectuar la diferenciación de células estromales de medula ósea para propósitos condrogénicos (Xu et al., 2019). C. Polivinil alcohol (PVA) Es un polímero sintético e hidrofílico, el cual se usa en ingeniería de tejidos, ya que cuenta con buenas propiedades mecánicas, no es toxico y es biodegradable, además de contar con una estructura química simple, compuesta de carbonos y grupos hidroxilos (Ilustración 5) (Teodorescu et al., 2018). Su obtención se da por medio de la polimerización de radicales de acetato de vinilo, seguido de un proceso de hidrolisis de los grupos de acetatos que su ubican a lo largo de las cadenas del polivinil acetato (PVAc). El PVA no siempre se obtiene con los mismos grados de hidrólisis, es por ello por lo que su estructura posee grupos acetato e hidroxilo colgantes, así mismo, este posee una temperatura de transición vítrea (Tg) de 80 °C (Schindler & Hauser, 2004; Teodorescu et al., 2019). Teniendo en cuenta lo anterior, algunos autores indican que la biodegradación de este material está relacionada con el ambiente al que se someterá, es decir, si el ambiente es acuoso este se degradara más rápido que si no lo es. Cabe mencionar que, este biomaterial es fácil de fabricar, posee buenas propiedades de adhesión, posee propiedades mecánicas estables y alta resistencia química. Ilustración 5. Estructura química del PVA (Jesse, 2005) Para finalizar, el PVA se ha usado en investigaciones para el reemplazo de tejido cartilaginoso dañado, ya que posee alto contenido de agua y una mecánica compresiva y elástica favorables para la aplicación, no obstante, este debe ser entrecruzado con otro material para generar estabilidad del andamio, y disminuir la respuesta inflamatoria del organismo (Baker et al., 2012). 1.3.5 Modelamiento computacional Hace referencia a un sistema dinámico, en el cual se tiene en cuenta la variación de las entradas, las cuales afectan a la salida del sistema, es decir que los valores y características que definen al elemento estudiado cambian bajo la influencia de factores externos. Es importante también que, el uso del modelado se debe a la complejidad del sistema real, sin embargo, el modelamiento es solo una aproximación (Sedivy & Hubalovsky, 2013). Finalmente, se debe comprender que bajo ciertas condiciones controladas el modelo computacional está ligado a un diseño asistido por computador (CAD, por sus siglas en inglés computer-aided design), ya que mediante este modelamiento grafico en CAD se pueden establecer parámetros tridimensionales de forma, los cuales recrean procesos mediante prototipos computacionales y, que a su vez, minimiza los costos y el tiempo de producción o experimentación (Sedivy & Hubalovsky, 2013). A. Evaluación computacional Es un análisis numérico que representan un comportamiento físico, lo cual se lleva a cabo mediante un software computacional al modelo generado a partir de un CAD o topología en 3D. Para lo anterior, se determinan las variables a medir de forma virtual según las condiciones preestablecidas, es decir, que la evaluación computacional corresponde a un proceso iterativo basado en cálculos numéricos que se aproximan al suceso real. Por último, esto permite validar ciertas propiedades mecánicas de esfuerzos, los efectos que estos provocan en la pieza y ahorrar costos experimentales, a su vez que se está examinando el suceso en tiempo real (Gonzalez, 2020). B. Modelamiento y evaluación computacional en biomateriales El modelamiento y evaluación computacional ha demostrado ser útil en el proceso de investigación, ya que se reducen los tiempos de espera y experimentación, a su vez que reducen ciertos costos involucrados al material y la constante experimentación (Di Federico et al., 2020). Lo anterior pueden entonces indicar que, un modelamiento computacional y su evaluación, le permiten a un investigador recrear y validar diferentes instancias de un experimento mecánico en un software de modelado basado en el método de elementos finitos (FEM por sus siglas en inglés, finite element method), a través del cual es posible realizar análisis (FEA, por sus siglas en inglés, finite element analysis) FEM o FEA en un tiempo igual o menor del que se requiere para recrear una porción del experimento físico en un laboratorio (Singh et al., 2019). A partir de lo anterior, se debe tener en cuenta que la ingeniería de tejidos no busca únicamente biomateriales con buenas propiedades de migración celular y porosidad, sino también materiales que posean unas propiedades mecánicas óptimas para su aplicación, ya que de estas dependen los estímulos mecánicos de la célula para su diferenciación. Es por esto que, el uso de herramientas de evaluación computacional para el modelado de elementos finitos (FEA) puede convertirse en una solución viable a largo plazo, pues al integrar el desarrollo del biomaterial, es posible que su producción sea más óptima y disminuya los costos de fabricación (Schipani et al., 2020). Así mismo, se han venido usando los elementos finitos para evaluar el cartílago, parametrizando la respuesta ante cargas mecánicas en la regeneración del tejido, sin embargo, mediante el uso de estos métodos de modelado no se es posible simular la tensión real que sufre el área a restaurar. Por lo tanto, este tipo de análisis computacionales aún está en proceso de estudio (Li et al., 2020). METODOLOGÍA 2.1 DISEÑO EXPERIMENTAL Para el diseño de experimentos, se establecieron variables fijas, variables de entrada y de salidas, junto con sus respectivos niveles. Dichas variables se establecieron así: • Variables fijas: concentración y peso molecular de polímeros alginato – gelatina – polivinil alcohol (Alg-Gel-PVA) • Variables de entrada: proporción de polímero en la muestra, orden de adición de polímeros a la solución de partida y tiempo de mezcla. • Variables de salida: tamaño de la microesfera, resistencia mecánica. En la Tabla 1, se muestra el diseño experimental preliminar que fue seleccionado para llevar a cabo la formación de las esferas de alginato – gelatina – polivinil alcohol (Alg-Gel- PVA), mientras que en la Tabla 2, se muestran las combinaciones de las variables de entrada, las cuales se deben realizar para analizar las variables de salida. Tabla 1. Diseño experimental preliminar FACTORES NIVELES 45 % - 45 % - 10 % 70 % - 20 % - 10 % Proporción en la mezcla Alg-Gel-PVA (% p/v) 20 % - 70 % - 10 % 80 % - 10 % - 10 % Alg sobre solución de Gel + PVA Orden de adición Gel sobre solución de Alg + PVA Total (tratamientos) (4 × 2) = 8 Tabla 2. Tratamientos derivados del diseño preliminar TRATAMIENTO DESCRIPCIÓN 1 Solución de 45 % de Alg sobre la mezcla de 45 % Gel y 10 % PVA 2 Solución de 70% de Alg sobre la mezcla de 20% Gel y 10% PVA 3 Solución de 20 % de Alg sobre la mezcla de 70 % Gel y 10 % PVA 4 Solución de 45 % de Gel sobre la mezcla de 45 % Alg y 10 % PVA 5 Solución de 20 % de Gel sobre la mezcla de 70 % Alg y 10 % PVA 6 Solución de 70 % de Gel sobre la mezcla de 20 % Alg y 10 % PVA 7 Solución de 80 % de Alg sobre la mezcla de 10 % Gel y 10 % PVA 8 Solución de 10 % de Gel sobre la mezcla de 80 % Alg y 10 % PVA 2.2 DESARROLLO DEL EXPERIMENTO Para llevar a cabo los experimentos, se fijaron las concentraciones de los tres polímeros a 3 %p/v, de igual manera se realizaron los cálculos para mantener una masa total de 250 mg para todas las muestras requeridas. 2.2.1 Esferas de Alginato/Gelatina/PVA A. Preparación de soluciones Se pesaron 0,75 g de cada polímero y, a cada uno de ellos, se le adicionaron 25 mL de agua destilada medida en una probeta, en un beaker de 50 mL. A partir de lo anterior, se obtuvieron 3 soluciones y se dejaron en agitación (Schott Instruments, EE. UU.) a 350 rpm, durante 40 minutos con una temperatura de 17 °C para el Alg (Sigma, EE. UU.) de viscosidad media, 30 °C para la Gel bovina tipo B (Sigma, EE. UU.) y 84 °C para el PVA (Sigma, EE. UU.) con peso molecular de 130000 Da y 99 % de hidrólisis. B. Solución de gelificación Se pesaron 2,22 g de CaCl2, a los cuales se le adicionaron 20 mL de agua destilada medida en una probeta, para una concentración final de 1 M. Seguido, se dejó en agitación (Schott Instruments, EE. UU.) a 17 °C y 350 rpm, por 30 minutos, que fue el tiempo requerido para que la solución fuera completamente homogénea. C. Preparación de la solución Alg/Gel/PVA Las soluciones de alginato, gelatina y PVA se mezclaron teniendo en cuenta los resultados obtenidos después de identificar mediante el diseño experimental, cuáles eran las proporciones que conducían a la formación de esferas. Por lo tanto, para realizar las mezclas se usaron las proporciones de Alg/Gel/PVA que se muestran en la Tabla 3. Cada mezcla se dejó en agitación durante 30 minutos, a una velocidad de agitación de 300 rpm. Tabla 3. Volumen de las muestras según su proporción Volumen Volumen de Volumen de Alginato (mL) Gelatina (mL) PVA (mL) Proporción 1 0,94 0,94 0,21 Proporción 2 1,46 0,42 0,21 Proporción 3 0,42 1,46 0,21 Proporción 4 1,67 0,21 0,21 D. Preparación de esferas de AlgNa/Gel/PVA En un beaker, se adicionaron 20 mL de la solución de gelificación a 300 rpm. Posteriormente, con una micropipeta de 1000 μL, se adicionaron gota por gota 160 μL de la solución Alg/Gel/PVA sobre la solución de gelificación, y se dejó estabilizando durante 15 minutos para obtener la esfera sólida deseada. Por último, pasados esos minutos se procede con un colador a efectuar el filtrado y recolección de la esfera para su almacenamiento y posterior uso. Tal como se puede observar en la Ilustración 6. Ilustración 6. Preparación de esferas de Alg-Gel-PVA 2.2.2 Caracterización de las esferas Alg/Gel/PVA A. Propiedades mecánicas con la máquina de ensayos universales Mediante el uso de la máquina de ensayos universal (INSTRON, EE. UU.) se llevaron a cabo pruebas con las esferas de Alg/Gel/PVA las cuales serán sometidas a compresión, usando una celda de carga de 1 N y una velocidad de 5 mm/min. Para llevar a cabo los ensayos se midieron los diámetros de cada esfera con un calibrador y se ingresaron los datos en el software BLUEHILL 2.21.748 (Denver Instruments, EE. UU.) para obtener gráficos de esfuerzo de compresión contra deformación. B. Morfología y esfericidad con software computacional Se determinó la morfología y el diámetro de las esferas de los respectivos tratamientos utilizando un estereoscopio (Nikon, Japón), esto con el fin de evaluar la morfología de las muestras y obtener radios máximos y mínimos. Una vez obtenidas las imágenes, se procedió a calcular la esfericidad mediante una fórmula que relaciona el eje mayor a y el eje intermedio b, los cuales no necesariamente deben cortarse en el mismo punto (Ilustración 7). Una vez se obtuvieron estos resultados se comparó con la Tabla 4 de formas establecida por Zingg en el año 1935 (Manayay et al., 2016). Ilustración 7. Relación de ejes a y b Tabla 4. Relación de forma de Zingg Formas Relación b/a Esféricos >2/3 Elipsoidales <2/3 2.2.3 Modelado y análisis computacional Para este apartado se establecieron tres geometrías 3D, las cuales fueron, un cubo, un cilindro y un prisma rectangular (Ilustración 8), estas se escogieron debido a que a través del tiempo han sido morfologías de andamios usadas en la regeneración de tejido con aplicaciones en cartílago (Wei & Dai, 2021). Dichas geometrías fueron diseñadas en el software FUSION 360 (Autodesk), el cual posee licencia educativa. Debe tenerse en cuenta que, cada geometría modelada en CAD conserva el volumen establecido de las esferas experimentales como punto de partida para validar el comportamiento a compresión durante la simulación; igualmente, se mantuvieron las cantidades en densidad y coeficiente de Poisson. A continuación, se efectuó un análisis computacional mediante elementos finitos usando el software SimScale®, donde se establecieron las condiciones iniciales o parámetros mecánicos iniciales, los cuales permitieron evaluar y validar las propiedades mecánicas a compresión de cada muestra. Por último, debido a que son tres geometrías distintas y cada una puede representar el mismo volumen, se optó por efectuar un modelo de simulación variable o de múltiples instancias, ya que se cambian sus propiedades mecánicas según el tratamiento que se simule, lo cual conduce a una variación del esfuerzo máximo a compresión. Ilustración 8. Geometrías modeladas mediante Fusión 360 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 3.1 ESFERAS DE ALG/GEL/PVA CON SUS DIFERENTES TRATAMIENTOS Inicialmente, se realizaron las esferas con todos los tratamientos que se mencionaron en la Tabla 2, usando un tiempo de gelificación de 5 min; sin embargo, se observó que aquellos que poseían una mayor concentración de gelatina (tratamientos 3 y 6) no tenían la morfología esperada, independientemente de la forma de adición. Lo anterior puede deberse a que la gelatina interfiere en las interacciones que puede realizar el alginato con el CaCl2 para formar las esferas, debido a las posibles interacciones entre los grupos amino de la gelatina (cargas positivas), con los grupos carboxilatos del alginato (cargas negativas) (Ilustración 9) (Derkach et al., 2019). Tratamiento 3 Tratamiento 6 Ilustración 9. Tratamientos con mayor porcentaje de Gelatina Del resultado anterior, se decidió descartar los tratamientos 3 y 6, es decir, 20 % de Alg sobre la mezcla de 70 % Gel y 10 % PVA y 70 % Gel sobre la mezcla de 20 % Alg y 10 % PVA, respectivamente. Por otra parte, para tratar de mejorar el proceso de formación de las esferas, se varió la velocidad de agitación de 300 rpm a 500 rpm; sin embargo, dichos cambios no condujeron a la obtención de muestras uniformes, por lo cual, finalmente, se fijó la agitación a 300 rpm y el tiempo a 15 min. Con estos nuevos cambios, se evidenció que para el tratamiento 4 y 5, no era posible obtener esferas (Ilustración 10). En este caso, se consideró que se priorizan las interacciones por enlace de hidrógeno entre el alginato y el PVA, dejando por fuera la gelatina, la cual no logra hacer interacción de manera adecuada. Sin embargo, esta suposición que se propone desde la estructura química de cada polímero, podría analizarse en estudios posteriores, en los que se incluyan técnicas de caracterización especializadas que permitan establecer la naturaleza de dichas interacciones. Tratamiento 4 Tratamiento 5 Ilustración 10. Morfologías obtenidas con los tratamientos 4 y 5 De acuerdo con los resultados obtenidos, se dejaron los tratamientos 1, 2, 7 y 8, que se muestran en la Tabla 5. Tabla 5. Tratamientos seleccionados TRATAMIENTO DESCRIPCIÓN 1 Solución de 45 % de Alg sobre la mezcla de 45 % Gel y 10 % PVA 2 Solución de 70 % de Alg sobre la mezcla de 20 % Gel y 10 % PVA 7 Solución de 80 % de Alg sobre la mezcla de 10 % Gel y 10 % PVA 8 Solución de 10 % de Gel sobre la mezcla de 80 % Alg y 10 % PVA En la Ilustración 11, se presentan las esferas según los tratamientos seleccionados, los cuales en su mayoría poseen una proporción mayor de alginato respecto a gelatina y PVA. Después de seleccionados los tratamientos que permitían obtener muestras aparentemente uniformes, se realizaron esferas individuales en la solución gelificante, haciendo adiciones sucesivas hasta obtener mínimo 10 esferas en la solución gelificante. A las esferas resultantes por este método, se les analizaron propiedades mecánicas y esfericidad (morfología) y los resultados obtenidos se usaron, posteriormente, para las simulaciones por elementos finitos. Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 7 Tratamiento 8 Ilustración 11. Estructura de las mezclas de Alg/Gel/PVA seleccionadas 3.2 PROPIEDADES MECÁNICAS Y ESFÉRICAS DE LAS MUESTRAS RESULTANTES 3.2.1 Propiedades mecánicas Con las esferas finales, se procedió a realizar el ensayo en la maquina INSTRON donde se evalúa la carga a compresión y su desplazamiento (Ilustración 12). Así mismo, se evalúa la resistencia a compresión y deformación de la muestra. Con lo anterior, la maquina es capaz de extraer el módulo de Young (Tabla 6) para cada muestra. Cabe aclarar que para cada tratamiento fue posible realizar cuatro replicas, lo que da como resultado un total de dieciséis. Debido a la cantidad de resultados se procede a establecer una media muestral mediante Excel, y así, poder reducir el número de resultados encontrados. Lo anterior se realiza con el fin conocer cuál de todos los tratamientos cumple con las propiedades mecánicas requeridas, sin embargo, según lo encontrado en los resultados obtenidos por la INSTRON todos los valores obtenidos son muy aproximados los rangos de módulo de Young expuestos previamente en el documento. Además, la Tabla 6 tiene contenida la media del diámetro, del máximo de carga, de la resistencia máxima y del módulo de Young, donde se puede notar que la media más alta de módulo de Young pertenece a la esfera que posee menor diámetro, es decir, menor volumen el cual se da gracias a su proceso de goteo en la solución gelificante. Este ensayo a compresión es seleccionado ya que, es uno de los esfuerzos más comunes, a los que se somete el cartílago articular. Tabla 6. Resultados de los ensayos entregados por la INSTRON Promedio Promedio Promedio con con con Resistencia desviación Módulo Máximo desviación N° Diámetro desviación a estándar de de Descripción de carga estándar Probeta (mm) estándar de compresión resistencia a Young (N) del módulo máximo de (kPa) la compresión (MPa) de young carga (N) (kPa) (Mpa) 1 4,3 Tratamiento 1,1 75 0,59 N°1. 2 5,4 Solución de 1,3 58 0,33 45 % de Alg 1,10 ± 0,29 68,5 ± 17,47 0,4 ± 0,18 3 4,3 sobre la 1 69 0,56 mezcla de 4 4,2 45 % Gel y 1 72 0,31 10 % PVA Tratamiento 5 4,1 1,2 89 0,69 N°2. 6 4,0 Solución de 1,1 89 0,72 70% de Alg 0,88 ± 0,31 71,5 ± 20,62 0,6 ± 0,17 7 3,8 sobre la 0,65 59 0,51 mezcla de 8 3,9 20% Gel y 0,59 49 0,35 10% PVA 9 4,2 Tratamiento 1,8 130 0,75 N°7. 10 3,8 Solución de 1,3 110 0,8 80 % de Alg 1,17 ± 0,55 92,7 ± 32,67 0,6 ± 0,23 11 3,4 sobre la 0,48 53 0,3 mezcla de 12 3,8 10 % Gel y 1,1 94 0,55 10 % PVA 13 3,2 Tratamiento 1,4 170 0,99 N°8. 14 3,4 Solución de 1,8 190 1,2 10 % de Gel 1,47 ± 0,30 160 ± 25,82 0,9 ± 0,21 15 4,0 sobre la 1,6 130 0,68 mezcla de 16 3,0 80 % Alg y 1,1 150 0,92 10 % PVA Por otro lado, como se mencionó, las lecturas de carga vs desplazamiento de los tratamientos a compresión se tomaron directamente de la máquina de ensayos universales; cada grafica representa la agrupación de cada tratamiento, de igual forma se puede observar que todos los materiales tuvieron un comportamiento similar, sin embargo, la Ilustración 12 parte d) muestra una mayor resistencia de carga antes de la rotura. Ilustración 12. Gráfico de carga vs desplazamiento de los tratamientos La curva esfuerzo vs deformación muestra el mismo comportamiento expuesto por Griffin y sus colaboradores, en su estudio referente al comportamiento del cartílago humano ante fuerzas de compresión, donde logran someter una muestra de cartílago a un ensayo a compresión y exponen la gráfica resultante. En este caso se encontró que la conformación de redes poliméricas sometidas a compresión muestran un comportamiento mecánico elástico, tal como se aprecia en la Ilustración 13 (Griffin et al., 2016). Así mismo, se puede apreciar que, en esta ilustración la parte h) contiene un mayor esfuerzo máximo de compresión respecto a e), f) y g). Tratamiento N°7 Tratamiento N°1 Tratamiento N°8 Tratamiento N°2 Ilustración 13. Gráfico de la curva esfuerzo vs deformación de los tratamientos 1,2,7 y 8, respectivamente 3.2.2 Esfericidad De acuerdo con el parámetro establecido para validar una esfera morfológicamente, es decir aquellas muestras que dependen de a y b, se puede afirmar que las muestras cumplen para el desarrollo de este trabajo, las cuales son conformes con la relación del diámetro mencionado previamente en este documento (Tabla 4). Además, se observa que la mayoría de las muestras analizadas tienen una aproximación muy cercana al valor unitario, que de llegarse a comparar con la morfología establecida por Zingg se pueden clasificar como esféricas, por lo cual se valida morfológicamente las muestras clasificadas considerando que es una aproximación experimental. Esto puede evidenciarse en la Tabla 7 donde se encuentran las dimensiones de cada diámetro el cual se logró medir usando el estereoscopio (Nikon, Japón) que posee la universidad. Tratamiento N°7 Tratamiento N°1 Tratamiento N°8 Tratamiento N°2 Tabla 7. Forma según la relación de forma de Zingg Ilustración Tratamiento a (µm) b (µm) b/a Forma 1 168,67 136,89 0,81 Esférica 2 124,66 148,40 1,19 Esférica 3 121,38 128,38 1,06 Esférica 4 115,92 132,50 1,14 Esférica 3.3 EFECTO MECÁNICO DE LA FORMA DE LA PROBETA Se hace uso del software Fusión 360 para llevar a cabo el modelado de las figuras geométricas. Para esto se seleccionaron la geometría de un prisma rectangular, de un cilindro y de un cubo, la cuales fueron escogidas debido a la implementación que han tenido en la ingeniería de tejido, donde “estudios recientes han informado de hallazgos atractivos sobre la regeneración concurrente de cartílago y hueso subcondral en el modelo de conejo utilizando estos andamios” (Wei & Dai, 2021), para esto las geometrías serán sometidas a una carga de compresión de 1 N con el fin de determinar cuál era su esfuerzo máximo a compresión; finalmente, se comparó con el esfuerzo máximo a compresión de las esferas experimentales, para así poder encontrar un diseño de andamio que fluyera mecánicamente con la aplicación de regeneración de tejido cartilaginoso. Para lograr el modelado es necesario fijar un volumen por tratamiento (Tabla 8), esto se hace mediante la fórmula de volumen de una esfera y mediante el uso de los diámetros medidos en la Tabla 6. Tabla 8 Tratamientos con su volumen para las simulaciones Volumen de cada Tratamiento Descripción Radio (mm) esfera (mm33) Tratamiento N°1. Solución de 45 % de 1 2,28 49,32 Alg sobre la mezcla de 45 % Gel y 10 % PVA Tratamiento N°2. Solución de 70 % de 2 1,98 32,27 Alg sobre la mezcla de 20 % Gel Y 10% PVA Tratamiento N°7. Solución de 80 % de 3 1,90 28,73 Alg sobre la mezcla de 10 % Gel y 10 % PVA Tratamiento N°8. Solución de 10 % de 4 1,70 20,58 Gel sobre la mezcla de 80 % Alg y 10 % PVA Dado que solo se conoce información sobre la esfera, se igualó la ecuación de volumen de una esfera según el tratamiento, con la del volumen de las otras geometrías, ya que este valor es independiente de la forma. Según lo anterior, se tiene que el prisma rectangular (Ilustración 14) posee la siguiente ecuación de volumen (Ecuación 1): 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑝𝑟𝑖𝑠𝑚𝑎 = 𝐴𝑛𝑐ℎ𝑜 ∗ 𝐿𝑎𝑟𝑔𝑜 ∗ 𝐴𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 Ecuación 1 Ilustración 14 Prisma rectangular sus dimensiones fijas y variables De la , se mantiene constante el largo y ancho del prisma rectangular, es decir, con dimensiones de 9 y 8 milímetros respectivamente, de tal forma que se obtengan varias de la geometría será únicamente la altura. En el caso del cilindro (Ilustración 15), la ecuación de volumen está dada de la siguiente forma (Ecuación 2): 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒄𝒊𝒍𝒊𝒏𝒅𝒓𝒐 = 𝝅𝒓𝟐𝒉 Ecuación 2 Ilustración 15 Volumen del cilindro a usar con altura fija y radio variables De la 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒄𝒊𝒍𝒊𝒏𝒅𝒓𝒐 = 𝝅𝒓𝟐𝒉 Ecuación 2 , se tiene como parámetro constante la altura y como parámetro variable el radio. Finalmente se procede con la ecuación del volumen de un cubo (Ilustración 16) (Ecuación 3): 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒄𝒖𝒃𝒐 = 𝒍𝒂𝒅𝒐𝟑 Ecuación 3 Ilustración 16. Representación gráfica de las dimensiones usadas para hallar el volumen de la geometría cúbica En la Ecuación 3 todos los parámetros son iguales, por lo cual se varía únicamente la longitud un lado del cubo. La información ordenada de estos cálculos se presenta en la Tabla 9. Tabla 9 Dimensiones de las figuras geométricas modeladas Prisma Tratamiento Cilindro Cubo rectangular N° (radio en mm) (lado en mm) (h en mm) 1 0,685 1,77 3,67 2 0,448 1,43 3,18 3 0,399 1,35 3,06 4 0,285 1,14 2,74 Una vez obtenidas las dimensiones y modeladas las geometrías, se procede a calcular la densidad según su tratamiento y la relación de Poisson que tiene el material, ya que como lo muestra la Ilustración 17 se requieren para llevar a cabo la simulación. Ilustración 17. Requerimientos de diseño para llevar a cabo la simulación según el tratamiento Para este caso, la densidad se determina a partir del volumen total, esto se puede hacer ya que todos los tratamientos realizados cuentan con un valor de 2083 𝑚𝑚3 y una masa total de 250 mg. La cifra anterior se estableció así desde el diseño experimental de las esferas, realizadas en el laboratorio. Considerando lo anterior, se procede a calcular la densidad (ρ) mediante la siguiente ecuación: 𝒎 𝝆 = Ecuación 4 𝒗 𝟐𝟓𝟎 𝒎𝒈 𝒎𝒈 𝝆 = = 𝟎, 𝟏𝟐 𝟐𝟎𝟖𝟑𝒎𝒎𝟑 𝒎𝒎𝟑 De la Ecuación 4, se observa que los valores son constantes y por consiguiente se deja el mismo valor de la densidad para el desarrollo de las simulaciones, este valor de densidad corresponde a 0,12 𝑚𝑔/𝑚𝑚3.Por otra parte, el coeficiente de Poisson (ν) debe ser constante para el desarrollo de las simulaciones, el cual para este caso se deja en un valor de 0,45, pues al tratarse de un biomaterial polimérico se plantea que este coeficiente se ubica entre rangos de valores establecidos en polímeros, los cuales oscilan entre 0,3 y 0,5. Finalmente, las consideraciones abren la posibilidad de ejecutar varias simulaciones, como se hace regularmente en trabajos de características similares. (Di Federico et al., 2020; Universidad de Valladolid, 2013). Siguiendo con el desarrollo de la simulación, se debe trabajar cada modelo geométrico individualmente en el software de FEA, para ello se fija una superficie plana de cada geometría generando así la restricción de movimiento, esto se hace mediante una condición de frontera de soporte fijo u anclaje, similar a la sujeción que se realiza en una de las mordazas o pinzas de la máquina de ensayos universal INSTRON. Después, es necesario aplicar una fuerza de compresión en el extremo opuesto de la pieza como se hace en el ensayo de laboratorio, por lo cual se debe aplicar una segunda condición de frontera en una superficie diferente. La fuerza aplicada tiene una magnitud de 1 N, la cual se aplicó a todas las simulaciones y se evaluó en el software según cada geometría; con el fin de comparar los esfuerzos que se generan en cada una. Una vez se tuvo listo el modelo geométrico y se definieron las condiciones de frontera, se procede a realizar la malla de simulación computacional; dicha malla está conformada por un grupo de elementos y nodos que deben adaptarse a la geometría en proporciones equivalentes, para desarrollar un sistema de ecuaciones que evalúan el comportamiento físico establecido. Dado que la malla juega un papel importante, ya que de ella depende la estabilidad y exactitud del modelado numérico (Cardozo, 2019; Gonzalez, 2020), se procede a realizar un análisis de sensibilidad de la misma la cual puede verse reflejada en la Tabla 10, este análisis consiste en realizar la simulación a diferentes grosores de la malla y establecer si hubo un cambio mayor al 10 % en los resultados obtenidos, esto con el fin de optimizar los recursos y estabilidad en el resultado. Tabla 10. Resultado del análisis de sensibilidad de la malla Calidad de Esfuerzo Geometría Tratamiento ER (%) la malla máximo 1 178,4 1 2 174,8 2% 1 209,2 2 2 209,2 0 % Cilin dro 1 256 7 2 256 0 % 1 282,4 10,3 % 2 322,1 14 % 8 3 379,8 18 % 4 392 3 % 1 168,4 1 2 168,4 0 % 1 220,6 2 2 220,6 0 % Cubo 1 233,4 7 2 233,4 0 % 1 291,2 8 2 291,2 0 % 1 23,54 1 2 24,12 2 % 1 21,77 2 2 23,19 7 % Prisma 3 22,39 3 % rectangular 1 21,3 7 2 20,63 3 % 1 19,52 8 2 20,93 7 % 3 20,93 0 % Para este caso se establece que todas las simulaciones y geometrías tendrán una malla con elementos tetraédricos de segundo orden y una calidad de malla, que varían según la geometría. De este modo, la Ilustración 18 ejemplifica como quedaría la malla en cada geometría. Ilustración 18. Geometrías diseñadas con su enmallado Finalmente, se llevaron a cabo todas las simulaciones de las geometrías las cuales muestran el resultado del esfuerzo máximo tomando esfuerzos de Von Mises como criterio de esfuerzos (Bramanti et al., 2017). Las primeras simulaciones llevadas a cabo fueron haciendo uso de la geometría del prisma rectangular, las cuales se comportaron de manera similar. Así mismo, unos tratamientos presentaban más concentraciones de esfuerzos en los bordes que otros. Sin embargo, esto no afecta la resistencia del material ante la compresión, ya que como se puede apreciar en la Ilustración 19 el esfuerzo máximo de compresión fue muy bajo indicando así, una mayor resistencia del material ante cargas compresivas. Cabe resaltar que las geometrías con bordes poseen mayor concentración de esfuerzos en esta zona, por lo tanto, se puede causar una ruptura del andamio en dichas áreas. Ilustración 19. Distribución del esfuerzo a compresión en el prisma rectangular usando escala de colores En consecuencia, se llevaron a cabo las simulaciones de las geometrías cúbicas, las cuales como se muestran en la Ilustración 20 poseen esfuerzos a compresión más altos que los de la geometría prismática, esto indica que ante cargas de compresión este material puede fallar con facilidad sobre todo en la base de este, ya que es allí donde se encuentran los valores más altos de esfuerzo a compresión, así mismo, su desempeño en la ingeniería de tejido cartilaginoso no será el mejor ya que no cuenta con la capacidad de imitar las propiedades mecánicas del cartílago. Ilustración 20. Resultado de la simulación de la geometría cubica donde se muestra el máximo esfuerzo a compresión y el interior de la figura mediante corte transversal y punto de máximo esfuerzo Por último, se realizaron las simulaciones con la geometría cilíndrica, las cuales se muestran en la Ilustración 21, esta geometría a diferencia de las otras presenta un alto esfuerzo a compresión en toda su estructura, es decir, posee menos resistencia a compresión y más fragilidad ante fuerzas mecánicas comparado con las otras, esto sin importar el tratamiento del biomaterial, ya que en todos presenta la misma propiedad. Ilustración 21. Geometría cilíndrica sometida a esfuerzo de compresión Una vez se finalizadas las simulaciones se procedió a realizar un resumen de resultados, los cuales se encuentran en la Tabla 11, en donde se muestra los esfuerzos máximos encontrados en las simulaciones realizadas, con el fin de poder establecer un método de comparación cuantitativo en términos de propiedades mecánicas y, así, seleccionar una posible topología de andamio entre las geometrías simuladas. Esto último, se debe a que no es posible simular mediante el software de elementos finitos las esferas experimentales, pues al poseer una superficie de contacto que tiende a cero los métodos numéricos que se usan en estos programas no la reconocen como se debe. Dicho esto, calcularon los esfuerzos máximos de las esferas mediante otra herramienta matemática para poder así establecer una relación de las geometrías totales expuestas en este documento. Tabla 11. Esfuerzos máximos de compresión según la geometría y tratamiento Esfuerzo Esfuerzo Esfuerzo Esfuerzo máximo máximo máximo máximo Geometría tratamiento tratamiento tratamiento tratamiento N°1 (kPa) N°2 (kPa) N°3 (kPa) N°4 (kPa) Prisma 24,12 22,39 20,63 20,93 rectangular Cubo 168,4 220,6 233,4 291,2 Cilindro 174,8 209,2 256 392 A lo largo de estas simulaciones, se puede establecer que no solo se aprovecha mucho mejor el recurso, sino que también se pueden establecer parámetros que ayuden al resultado final, tal es el caso del análisis de sensibilidad de malla, la cual garantiza una estabilidad del resultado final sin necesidad de gastar recursos computacionales que en una investigación pueden ser traducidos en tiempo y dinero. Dicho esto, se tiene que el análisis de elementos finitos llevados a cabo, permitió establecer relaciones entre las geometrías del biomaterial compuesto de Alg/ Gel/ PVA, los diferentes tratamientos seleccionados y su resistencia a la compresión, ya que se pudo identificar que las estructuras cilíndricas y cubicas no resultan favorables para la reparación del cartílago, puesto que este tejido debe soportar altas cargas, y ante estas geometrías el material se fracturaría de forma rápida, por lo cual no es recomendable para aplicaciones del tejido cartilaginoso debido a que los andamios no cumplen con esta propiedad mecánica. Además, no brindaría la estimulación mecánica requerida para la proliferación de condrocitos, ya que al ser de fácil rotura no se podrán ejercer grandes presiones y por ende no abra señalización por parte de esta célula, puesto que como se mencionó con anterioridad al ser una célula mecano sensible requiere de estos incentivos mecánicos para funcionar correctamente. Hasta aquí, teniendo en cuenta estos resultados obtenidos se puede establecer entonces que el diseño del andamio de geometría de prisma rectangular, puede ser una opción viable en aplicaciones con condrocitos si se usa la mezcla de Alg/ Gel/ PVA, con la forma de fabricación del tratamiento N°7, ya que, aunque todos los tratamientos de fabricación presenten buena resistencia mecánica, es el N°7 el que posee una mejor relación entre sus dimensiones, y sus propiedades mecánicas. Sin embargo, aún es necesario comparar estos valores de esfuerzos con las esferas experimentales, ya que de esta manera se podrá tener un resultado más objetivo, razón por la cual se emplea la mecánica de contacto la cual se expondrá más adelante. 3.4 EFECTO DEL MATERIAL EN LA RESISTENCIA En este apartado, se pretende calcular los esfuerzo máximos de compresión de las esferas experimentales lo cuales no pueden ser estimados mediante el uso de elementos finitos, ya que su geometría hace que los resultados incidan en un error de la medición, por consiguiente, los esfuerzos máximos de compresión de las esferas deben ser calculados mediante la mecánica de contacto (Popov et al., 2020), pues dicha geometría al poseer áreas que tienden a cero aumenta el valor del esfuerzo a infinito, lo cual no sucede en la vida real. Para ello se tomará la información de la Tabla 6, con el fin de calcular 16 esfuerzos máximos a los cuales se les sacara una media y desviación estándar con el fin de tener un resumen de resultados a comparar con las simulaciones, Dicho esto se tienen las siguientes ecuaciones: La Ecuación 5 relaciona los módulos y coeficientes de Poisson de cada tratamiento con el plato de compresión, es decir, la pieza que se usa para llevar a cabo los ensayos de compresión en la máquina universal de ensayos, en este caso se usará el aluminio 4340, ya que es un material de alta dureza, el cual posee un módulo de Young de 192000 MPa y un coeficiente de Poisson de 0,29 (Matweb, n.d.). De igual forma, para representar el biomaterial se deja el mismo coeficiente de Poisson usado en las simulaciones, que corresponde a 0,45 y se varía el módulo de Young según sea el caso. 1 1 − 𝜈12 1 − 𝜈22 = + Ecuación 5 𝐸∗ 𝐸1 𝐸2 Donde: 𝐸∗𝑒𝑠 𝑒𝑙 𝑒𝑞𝑢𝑖𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑚𝑜𝑑𝑢𝑙𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑦𝑜𝑢𝑛𝑔 E1 corresponde al módulo de Young según el tratamiento E2 corresponde al módulo de Young del acero 4340 que simula INSTRON 𝜈12 = 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑃𝑜𝑖𝑠𝑠𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑖𝑚𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (0,45) 𝜈22 = 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑃𝑜𝑖𝑠𝑠𝑜𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑐𝑒𝑟𝑜 4340 Por otro lado, la 2 𝑑 𝜌 = 𝐸∗√ Ecuación 6 0 𝜋 𝑅 establece el cálculo de los esfuerzos máximos de compresión para cada esfera, teniendo calculado el E equivalente y los datos de deformación que serán adquiridos de las gráficas de carga vs extensión (Ilustración 12) y el radio de cada esfera. 2 𝑑 𝜌 = 𝐸∗√ Ecuación 6 0 𝜋 𝑅 Donde 𝜌0 es el esfuerzo máximo a compresión d = deformación del material R= radio promedio según el tratamiento Dicho esto, en la Tabla 12 se muestran los resultados para los 16 ensayos realizados. Tabla 12. Resultado de esfuerzo máximo en esferas experimentales Promedio de N° 𝝆 (𝒌 𝑷𝒂) con E (MPa) d (mm) R (mm) 𝝆 (𝒌 𝑷𝒂) 𝟎 Probeta 𝟎 la desviación estándar 1 0,43 1,5 2,2 94,43 2 0,29 1,3 2,7 44,86 80,34 ± 28,3 3 0,41 1,8 2,2 109,93 4 0,28 1,7 2,1 72,13 5 0,46 1,5 2,1 108,04 6 0,47 1,7 2,0 128,37 110,91 ± 16,4 7 0,39 1,8 1,9 117,62 8 0,31 1,8 2,0 89,62 9 0,48 1,2 2,1 88,15 10 0,50 1,5 1,9 125,85 94,49 ± 21,1 11 0,27 1,6 1,7 81,89 12 0,41 1,2 1,9 82,06 13 0,55 1,1 1,6 121,20 14 0,60 1,2 1,7 134,98 129,47 ± 23,8 15 0,46 1,4 2,0 102,55 16 0,54 1,4 1,5 159,14 A continuación, se comparan los resultados obtenidos en la Tabla 11, la cual contiene los esfuerzos máximos resultantes de las simulaciones con los resultados de esfuerzo máximos de las esferas realizadas en laboratorio (Tabla 13): Tabla 13 Esfuerzos máximos y geometrías Esfuerzo Esfuerzo Esfuerzo Esfuerzo máximo máximo máximo máximo Geometría tratamiento tratamiento tratamiento tratamiento N°1 (kPa) N°2 (kPa) N°7 (kPa) N°8 (kPa) Prisma 24,12 22,39 20,63 20,93 rectangular Cubo 168,4 220,6 233,4 291,2 Cilindro 174,8 209,2 256 392 Esferas 80,34 110,91 94,49 129,47 Una vez obtenidos todos los datos de las geometrías estudiadas se puede establecer que, según este análisis, mecánicamente la geometría del prisma rectangular es la mejor opción para aplicaciones de tejido cartilaginoso, sin embargo, las esferas también presentan propiedades mecánicas que van a fin de la ingeniería de cartílago, la cual es el cultivo exitoso de condrocitos. Además, esta ultimas poseen gran cantidad de estudios científicos que corroboran el uso de esta geometría para dicha aplicación, uno de ellos fue realizado por Yeung y colaboradores, los cuales mediante la creación de microesferas de colágeno pudieron establecer que el uso de esta geometría ayuda a mantener el fenotipo del cartílago en humanos, al mismo tiempo que permite responder a factores externos, lo cual es importante para el desarrollo y diferenciación del condrocito (Yeung et al., 2019). Así mismo, Yichi Xu y colaboradores han estudiado microesferas realizadas con gelatina y alginato, y han establecido que esta geometría brinda una fácil manipulación in vitro para la diferenciación condrogénica lo cual es una ventaja a la hora de realizar procesos de cultivo celular. No obstante, la geometría esférica a comparación de los andamios rectangulares, resulta ser sencillo de construir en el laboratorio, toma menos tiempo, se mimetiza con el tejido y puede ser estandarizado de manera más sencilla que los prismáticos, los cuales requerirían más tiempo de fabricación y no se tiene certeza de si van a funcionar. Teniendo en cuenta lo anterior, se decide entonces que en vista de los avances científicos que validad la decisión, se toma la geometría esférica compuesta por una solución de 10 % de Gel, 80 % Alg y 10 % PVA (tratamiento N° 8) como la mejor opción para la fabricación de un andamio que puede funcionar en la ingeniería de tejido cartilaginoso y que es mecánicamente resistente ante fuerzas de compresión, sin embargo queda como reto demostrar experimentalmente si este biomaterial puede servir como andamio de condrocitos para la regeneración del cartílago articular. CONCLUSIONES Y CONSIDERACIONES FINALES De los resultados obtenidos en este documento se concluye que fue posible establecer las condiciones de mezcla requeridas para la conformación de esferas homogéneas y que cumplieran con las propiedades mecánicas requeridas para la posible regeneración de tejido cartilaginoso. En este caso, se analizaron diferentes condiciones de mezcla y proporciones de los polímeros y se encontró que con cuatro de los tratamientos propuestos (1, 2, 7 y 8), se obtuvieron esferas de alginato, gelatina y PVA, por lo tanto, se pudo establecer un protocolo de obtención de dichas esferas, usando una mezcla ternaria. Por otro parte, al evaluar la morfología de estas esferas mediante la razón de Zingg, se obtuvo que todos los diseños analizados cumplieron con el criterio de esfericidad. Así mismo, las propiedades mecánicas de las esferas realizadas en el laboratorio tienen consistencia con la aplicación a realizar, ya que en todos los casos se cumple que el módulo de elasticidad concuerda con la literatura, dando validez al ensayo mecánico y al biomaterial diseñado. Así mismo, cabe considerar que el tratamiento 8 fue el que mejores propiedades tuvo cuando se realizaron las pruebas mecánicas de la geometría esférica. En lo que se refiere a los esfuerzos de compresión del prisma rectangular y las esferas, se evidenció que ambas poseen buenas propiedades mecánicas, siendo mejor la primera geometría, que la segunda. Sin embargo, es posible concluir que las esferas siguen siendo la mejor geometría debido a las investigaciones en el campo de la ingeniería de cartílago, considerando la facilidad de fabricación de las esferas, su biomimetización con el cartílago nativo, sus propiedades comprobadas para la diferenciación de condrocitos y regeneración del tejido. Es decir, la geometría más apta para las aplicaciones de tejido cartilaginosos son las esferas, más precisamente, aquellas obtenidas usando una proporción de 10 % de Gel, 80 % Alg y 10 % PVA (tratamiento 8). De igual forma, el uso modelos de elementos finitos para la evaluación de otras geometrías, permitió dar una estimación del comportamiento del material con otra morfología, ampliando las opciones de análisis para la aplicación de diferentes andamios a la ingeniería de cartílago. Teniendo en cuenta los resultados de las simulaciones, no es viable el uso de geometrías cilíndricas o cúbicas, ya que tienen un esfuerzo a compresión muy elevado, es decir, su resistencia ante cargas es mínima y no es apto para aplicaciones relacionadas al cartílago, las cuales requieren de una alta capacidad de resistencia a cargas de compresión. Para finalizar, este documento se realizó teniendo en cuenta un enfoque basado en evaluación de las fuerzas mecánicas a compresión. No obstante, queda como objeto de estudio la realización in vivo del cultivo de condrocitos en este biomaterial con el fin de evaluar propiedades biológicas y poder validar la aplicación propuesta en un inicio. REFERENCIAS Afewerki, S., Sheikhi, A., Kannan, S., Ahadian, S., & Khademhosseini, A. (2019). Gelatin- Polysaccharide composite scaffolds for 3D cell culture and tissue engineering: towards natural therapeutics. Bioengineering & Translational Medicine, 4(1), 96. https://doi.org/10.1002/BTM2.10124 Armiento, A., Stoddart, M., Alini, M., & Eglin, D. (2018). Biomateriales para la ingeniería de tejidos del cartílago articular: aprendizaje de la biología. Acta Biomaterialia, 65, 1–20. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2017.11.021 Asma, C., Meriem, E., Mahmoud, B., & Djaafer, B. (2014). Physicochemical characterization of gelatin-cmc composite edibles films from polyion-complex hydrogels. 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